ТОКСИКОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕЛЬТАМЕТРИНУ У ФОРМІ ДЕЦИС ФОРТЕ

Короткий зміст

Робота виконувалась упродовж 1998 – 2006 років у лабораторії токсикологічного моніторингу Центру токсикологічних досліджень, ветсанекспертизи, сертифікації кормів та продуктів тваринництва ННЦ «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини».

Виконання експериментальної частини базувалося на загальновизнаних методах досліджень як вітчизняних, так і зарубіжних учених.

У проведених дослідженнях був використаний децис форте 12,5 % к.е. (реєстраційний номер Б 00189 Управління безпеки хімічних речовин України). Стандартні розчини інсектициду – 1, 10 та 100 мкг/см³ –  готували на гексані. Під час визначення ступеня токсичності на біологічних об’єктах (культурі клітин, тваринах) використовували водні розчини децис форте.

Удосконалення методики ґрунтувалося на: „Методических указаниях по определению синтетических пиретроидов (амбуш, децис, рипкорд, сумицидин) в растениях, почве, воде водоемов методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии” (Д.Б. Гиренко, М.А. Клисенко и др.), затверджених 22.10.81 № 2473-81, які й до сьогодні використовуються в лабораторіях.

Залишки дельтаметрину визначали способом тонкошарової хроматографії. Дослідження передбачали вилучення інсектициду з матриці, підбору оптимального екстрагенту (органічного розчинника), відпрацювання очищення екстрактів – фільтрації, виморожування, перерозподілу в системах розчинників, що не змішуються, та хроматографії на колонках.

Відповідно до стандарту „ІSO 5725-1:1994” встановили валідаційні характеристики удосконаленого методу, які передбачали визначення: специфічності, точності, лінійності, відтворюваності, меж детектування та визначення методу, стабільності дельтаметрину в розчині та матриці.

Дослідження з установлення параметрів гострої токсичності децис форте після одноразового перорального введення білим щурам здійснювали за методичними рекомендаціями (Косенко М.В., Малик О.Г., Коцюмбас І.Я. та ін., 1997). DL₅₀  підраховували, використовуючи метод найменших квадратів для пробіт-аналізу кривих летальності в модифікації Прозоровського В.Б. (1962), а похибку – за методом Miller та Tainter (Miller C.L., Tainter M.L.,1944).

Патологоанатомічний розтин тварин, що загинули, здійснювали з фіксацією змін у органах і тканинах (Жаров А.В., Іванов І.В., Стрельников А.П., 2003)

Цитотоксичні властивості децис форте, його здатність впливати на виникнення патологій, пов’язаних із зміною структури й функціонування клітин, вивчали на перещеплюваній культурі клітин нирки великої рогатої худоби МDBК. Клітини вирощували в ростовому середовищі Ігла і 199 (1:1) з додаванням 10 % нативної сироватки крові великої рогатої худоби. Інкубували їх за температури 37 °С у культуральних флаконах упродовж 48 годин до утворення моношару клітин. Токсичні концентрації дельтаметрину визначали під час мікроскопічного дослідження після 24–х годинної експозиції моношарової культури. Цитотоксичні властивості оцінювали за цілісністю моношару та ступенем його пошкодження, характером розташування елементів клітин та їх кількістю із зернистою цитоплазмою.

Для вивчення впливу децис форте на мітотичний режим клітини MDBK висівали на накривні скельця розміром 12 х 24 мм і розміщували в культуральних флаконах. Після формування моношару клітин у ростове середовище вносили різні концентрації інсектициду з подальшим визначенням мітотичних параметрів клітин.

Клітини фіксували спиртово-оцтовим розчином (3:1) через 24, 48 і 72 години після внесення дельтаметрину. Препарати фарбували гематоксиліном Карачі згідно методичним рекомендаціям (Голідонова Н.Д., Джарилгасов С.А., Падалкін В.П., 1977; Білокінь В.С., Стегній Б.Т., Берус П.Т та ін., 1993).

Вивчення патологічних форм мітозу здійснювали за класифікацією Алова А.І. (Авцин А.П., Шаламов В.А., 1979; Адамс Р.,1983), визначаючи їх частку від загальної кількості мітозів.

Досліди щодо вивчення токсикокінетики та токсикодинаміки дельтаметрину у формі децис форте 12,5 % к.е. проводили в гострому та хронічному експериментах на курях м’ясо-яєчного напрямку породи білий леггорн, віком 5 і 18 місяців.

Після закінчення адаптаційного періоду курям у гострому досліді одноразово індивідуально вводили водну емульсію децис форте в дозах 50 мг/кг (перша група) та 100 мг/кг маси тіла (друга група). Контрольна група курей одержувала воду, вільну від інсектициду. У хронічному експерименті курям першої групи щоденно згодовували корм із піретроїдом у дозі 5 мг/кг, а другої – у дозі 20 мг/ кг корму протягом шестидесяти діб. Контрольна група птахів одержувала корм, без вмісту препарату.

Під час проведення гострого і хронічного дослідів на курях залишкові кількості дельтаметрину визначали із застосуванням методу газорідинної хроматографії, розробленого співробітниками Центру токсикологічних досліджень ННЦ „ІЕКВМ”. Досліджували кров, головний мозок, серце, легені, селезінку, нирки, внутрішній жир, печінку, білу та червону м'язові тканини, вмістиме м’язового шлунка, дванадцятипалої кишки в гострому досліді – на першу, третю, сьому та чотирнадцяту доби; у хронічному досліді – на шестидесяту добу.

Під час проведення гістоморфологічних досліджень зразки органів фіксували у 10 % розчині нейтрального формаліну та в рідині Карнуа. Гістологічні зрізи готували з парафінових блоків, фарбували за методом Браше (метиловим зеленим та піроніном G), гематоксиліном та еозином. Також визначали загальний стан органів та окремих їх складових структур, оцінювали характер гістологічних змін, поширення патологічних та інволютивних проявів, довжину складових клітин, їх конфігурацію, густину епітеліального та ступінь розвитку поверхневого мозкового шарів (Саркісов Д.С., Петров Ю.Л.,1996).

У крові визначали число еритроцитів і концентрацію гемоглобіну (Заболоцький В.Т., Поляков Б.Ф., 1965); глюкози – за кольоровою реакцією з орто-толуїдином, піровиноградної кислоти – за модифікованим методом Умбретта (Самохін В.Т., Кондрахін І.П. та ін., 1981; Колб В.Г., Камишніков В.С., 1982), молочної кислоти – за Баркером і Саммерсоном (Кондрахін І.П., 1985); у сироватці крові – активність аланінамінотрансферази (АЛТ) та аспартатамінотрансферази (АСТ) – за кінетичним методом Рейтмана та Френкеля в модифікації Ошерович А.М., Мільнер Б.І. (1965), аденозинтрифосфатази (АТФ-азу) (Прохорова М.І., 1982), лужної фосфатази (ЛФ) – за Бессеєм, Лоурі та Броком (Васільєва Е.А., 1982).

Для визначення активності АЛТ, АСТ, ЛФ у печінці та ЛФ у нирках і стінці дванадцятипалої кишки зразки органів після розтину охолоджували, гомогенізували за допомогою скла і відповідних субстратно–буферних розчинів у співвідношенні 1:50. Для АЛТ використовували 50 мМ трис–НСІ буфер, АСТ – 0,25 М сахарозу на 0,05 М трис–НСІ буфері, для ЛФ – 0,05 М гліциновий буфер з 5,5Ч10^–3 розчином р –нітрофенілфосфату. Гомогенізат центрифугували, фільтрували та зберігали в умовах побутового холодильника.

У статистичних підрахунках та обробці даних  використовували методи варіаційної статистики та комп’ютерну програму Microsoft Office Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Удосконалення методики визначення залишків дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії. Контроль за залишковими кількостями дельтаметрину в сільськогосподарській продукції є актуальним та потребує розробки нових або вдосконалення існуючих методів визначення.

Для покращання методики визначення залишків пестициду в біологічному матеріалі ми врахували основні вимоги, а саме: підбір екстрагенту, який забезпечує максимальне вилучення препарату із зразка, пробопідготовку (очищення, вивільнення від коекстрактивних речовин, виморожування жирів, тощо) та способи виявлення пестициду на платівці.

Під час підбору умов екстракції зразків молока оптимальними виявилися як екстрагент – ацетон у співвідношенні 1:2, так і використання електромеханічного струшувача протягом 30 хвилин. Виморожування впродовж 3 годин за температури 18 – 20 °С найкраще забезпечувало звільнення зразків від жиру. За цих умов на поверхні охолодженого ексктракту встановлено добре застиглі краплі молочного жиру. У процесі удосконалення системи рухливих розчинників, яка характеризувала положення пестициду на платівці з УФ-індикатором, найкращою виявилася система гексан–ацетон у співвідношенні 5:1, Rf становило 0,67 – 0,69. Після обробки платівки 1,5 %-ним розчином бензидину в ацетоні та опромінення УФ-променями дельтаметрин виявлявся у вигляді темно-синіх плям на жовто-коричневому фоні впродовж 1 – 2 хвилин. У наших дослідженнях найбільш придатними виявилися платівки для тонкошарової хроматографії «Реасорб» (алюмінієва підкладка, сорбент – силікагель КСКГ) марки ТХС-КСКГ–УФ 254.

Отримані результати є основою вдосконаленого методу визначення дельтаметрину в молоці способом тонкошарової хроматографії.

Новизна способу детекції дельтаметрину в молоці захищена деклараційним патентом України № 18281 від 15 листопада 2006 року „Спосіб визначення дельтаметрину в молоці”.