ДЗЕЦЮХ ТЕТЯНА ІГОРІВНА ОСОБЛИВОСТІ ПЕРЕБІГУ ГОСТРОГО ПАРОДОНТИТУ ЗА УМОВ ГІПОТИРЕОЗУ В ЕКСПЕРИМЕНТІ

Короткий зміст

Матеріали і методи дослідження. Для вивчення особливостей перебігу гострого пародонтиту на тлі мерказоліл-індукованого гіпотиреозу використовували білих безпородних щурів-самців, які утримувалися на стандартному раціоні віварію при вільному доступі до води. В кожну експериментальну групу було включено 10 тварин масою 220–250 г. Всі маніпуляції з експериментальними тваринами проводили із дотриманням правил, передбачених Європейською конвенцією по нагляду за проведенням лабораторних та інших дослідів з участю експериментальних тварин (European convention, 1986), та згідно з "Науково-практичними рекомендаціями із утримання лабораторних тварин та роботи з ними" (Кожемякін, 2002) і наказом МОЗ України № 690 від 23.09.2009 р. Комісією з біоетики ДВНЗ "Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського МОЗ України" порушень етичних норм при проведенні дослідження не виявлено (протокол № 10 від 16.01.2012 р.).
Гіпотиреоз моделювали щоденним введенням per os за допомогою спеціального зонда фармакопейного тиреостатика мерказолілу («Акрихин», Росія) у дозі 25 мг/кг протягом 21-ї доби (Isman C.A., Yegen B.C., 2003). Повноту досягнення гіпотиреозу контролювали вимірюванням концентрації трийодтироніну і тироксину в сироватці крові.
Вплив гіпотиреозу на перебіг запального процесу вивчали на моделі запалення, викликаного гострою механічною травмою м’яких тканин ясен (Мачоган В.Р., Авдєєв О.В., 2011). Тваринам під тіопенталовим наркозом (30 мг/кг) з губної сторони здійснювали механічне пошкодження направленими ультразвуковими коливаннями частотою 50 кГц і потужністю 1,2 Вт см2 протягом 60 с за допомогою ультразвукового скейлера ART (Великобританія).
Для корекції використовували комбіновані таблетки, що містять екстракт з кореня ехінацеї, кислоту аскорбінову і цинку аспарагінат під робочою назвою «Ехцивіт» (Грошовий Т.А., Коваль В.М., 2013) у дозі 37 мг/кг, яку розраховували за спеціальною методикою (Рыболовлев Ю. Р., 1989). Досліджувані зразки суспендували з дистильованою водою та вводили внутрішньошлунково зондом протягом двох тижнів після першого введення мерказолілу та протягом наступних 1-ої і 8-ми діб моделювання гострого пародонтиту.
Експериментальних тварин розділили на 5 груп: І – інтактні тварини, яким перорально вводили дистильовану воду протягом 21-ї доби; ІІ – тварини, яким моделювали гіпотиреоз шляхом перорального уведення мерказолілу в дозі 25 мг/кг протягом 21-ї доби; ІІІ – тварини, яким моделювали гострий пародонтит; IV – тварини, яким моделювали гострий пародонтит на тлі гіпотиреозу; V – тварини, яким моделювали гострий пародонтит на тлі гіпотиреозу і проводили корекцію.
В процесі експерименту проводили спостереження за поведінкою тварин, кольором шерсті, поїданням кормів.
Для дослідження брали цільну кров, сироватку крові, плазму крові та гомогенат ясен. Тварин декапітували під тіопенталовим наркозом на 2-у і 8-у доби від моменту моделювання пародонтиту.
Функціональну активність нейтрофілів оцінювали за допомогою спонтанного НСТ-тесту (сНСТ-тест) (Г.И. Гордиенко, 2003). Результат виражали у відсотках диформазанпозитивних нейтрофілів від загального числа підрахованих клітин. Для визначення функціонального резерву нейтрофілів використовували індукований НСТ-тест (іНСТ-тест), для цього в середовище інкубації додатково додавали 0,05 мл пірогеналу. Результат виражали у відсотках диформазан-позитивних клітин на 100 нейтрофілів. Розраховували також показник резерву (ПР) за формулою іНСТ/сНСТ, а також коефіцієнт метаболічної активації нейтрофілів (Какт) за формулою: іНСТ – сНСТ/іНСТ. Продукцію активних форм кисню (АФК) у мононуклеарних лейкоцитах (МНЛ) визначали методом проточної цитофлуориметрії на апараті Epics XL («Beckman Coulter», США) з використанням барвника дихлорфлюоресцеїну діацетат (ДХФ-ДА) («Sigma Aldrich», USA).
Дослідження клітинної (CD4+, CD8+) ланки імунітету здійснювали імунофлуоресцентним методом за допомогою моноклональних антитіл до CD4+, і CD8+ антигенів щура, кон’югованих із флуоресцеїн ізотіоціонатом (FITC) виробництва Beckman Coulter (США). Імунореактивність організму вивчали за вмістом сироваткових імуноглобулінів (Ig) А, М, G методом твердофазового імуноферментного аналізу з допомогою набору реагентів «eBioscience, Inc» та циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у крові (М.Ю. Гаєвська, 2000).
Цитокіновий профіль сироватки крові визначали за допомогою набору реагентів “ELISA Kit for Rat Uscn, Life Science Inc”: інтерлейкіну-1β (IL-1β), інтерлейкіну-4 (IL-4), інтерлейкіну-10 (IL-10), фактору некрозу пухлин α (ФНП¬α) на аналізаторі STAT-FAX.
Вміст ВГ в гомогенаті ясен і гемолізаті еритроцитів визначали методом Ellman G., 1977. Концентрацію глутатіону виражали в гомогенаті ясен в мг/г, в гемолізаті – в мг/л. Вміст гідропероксидів ліпідів (ГПЛ) визначали спектрофотометричним методом (Волчегорский И.А., 1989) і виражали в умовних одиницях екстинкції. Концентрацію ТБК-активних продуктів оцінювали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Э.Н. Коробейникова, 1989). і виражали в сироватці в мкмоль/л, у гомогенаті – в мкмоль на 1 г білка. Концентрацію продуктів окиснювальної модифікації білків (ОМБ) визначали методом, запропонованим І.Ф. Мещишеним (1998). Супероксиддисмутазну активність (СОД) визначали загальновизнаним методом (Beachamp C., 1974) у модифікації Чевари С. (1985). Каталазну активність визначали за здатністю гідроген пероксиду утворювати з молібдатом амонію стійкий забарвлений комплекс (Королюк М.А., 1988). Рівень церулоплазміну (ЦП) визначали колориметричним методом (Колб В.Г., 1982). Вміст загального тироксину, загального трийодтироніну і ТТГ у сироватці визначали імунофлуоресцентним методом з використанням стандартних тест-наборів «Immulite 1000» на автоматичному імуноферментному аналізаторі фірми «Elecsys 2010» Roche Hitachi. Концентрацію гормонів виражали в пкмоль/л.
Еритроцитарний індекс інтоксикації (ЕІІ) визначали за методом Тогайбаева А.А. (1988). Визначення молекул середньої маси (МСМ) проводили згідно з методикою Оськіна В.В. (1987).
Визначення достовірності відмінностей порівнюваних параметрів між різними вибірками проводили з використанням t-критерію Стьюдента (при нормальному розподілі результатів) чи Манна-Уітні (у випадку розподілу, що не був нормальним). Достовірним вважали відмінності при р<0,05. Для розрахунків використовували комп’ютерну програму Microsoft Excel XP.
Результати досліджень та їх обговорення. З метою оцінки функціонального стану щитоподібної залози при моделюванні гіпотиреозу були визначені концентрації тиреоїдних гормонів у крові. Рівень тироксину у здорових щурів склав (18,39±0,61) пмоль/л, а у тварин, яким вводили мерказоліл був нижчим у 2,2 раза і становив (8,51±0,35) пмоль/л. Вміст трийодтироніту у інтактних щурів становив (6,27±0,23) пмоль/л, після уведення мерказолілу був у 1,9 раза нижчим від показників у інтактних щурів і склав (3,2±0,086) пмоль/л. Це вказує, що уведення мерказолілу у дозі 25 мг/кг спричиняє розвиток у тварин вираженого гіпотиреозу.
Рівень активних форм кисню (АФК) у тварин з гіпотиреозом становив 68 % від показника інтактних тварин, що можна вважати наслідком зниження активності метаболічних процесів за умов дефіциту гормонів щитоподібної залози. Запальний процес супроводжувався розвитком оксидативного стресу, що характеризується збільшенням інтенсивності продукування АФК. На 2-у добу гострого пародонтиту у еутиреоїдних тварин його продукція становила 249 % від рівня інтактних, а до 8-ї доби від моменту моделювання патологічного процесу показник дещо знизився і становив 227 % від норми, однак у 3,4 раза перевищував показник тварин з гіпотиреозом. Моделювання гострого пародонтиту щурам, яким вводили мерказоліл, призвело до значно меншого зростання АФК, ніж у еутиреоїдних тварин. На 2-у добу показник становив 184 % від рівня інтактних тварин, на 8-му – 165 %.
Аналогічна тенденція спостерігалась стосовно початкових і проміжних продуктів ліпопероксидації. Зокрема, у тварин з гіпотиреозм концентрація ГПЛ була нижчою від рівня інтактних тварин на 25 % у сироватці крові і на 28 % у гомогенаті ясен. Вміст ГПЛ у сироватці крові тварин з гострим пародонтитом на 2-у добу становив 213 % від аналогічного показника інтактних тварин, а на 8-му – 180 %, тоді як за умов моделювання гострого пародонтиту на тлі гіпотиреозу відповідно 116 % і 110 %. У гомогенаті ясен щурів з гострим пародонтитом показник зріс в 1,5 раза на 2-у і 1,1 – на 8-у добу, а у тварин з попереднім уведенням мерказолілу на 2-у добу показник перебував на рівні здорових тварин, однак до 8-ї доби зростав до 111 %.
Зниження продукції супероксидного аніон-радикала НАДФН-оксидазою нейтрофілів у щурів з гіпотиреозом супроводжувалось також зменшенням рівня кінцевого продукту ліпідної пероксидації – ТБК-активних продуктів у гомогенаті ясен з вогнища ушкодження і в сироватці крові на всіх етапах експерименту. За умов експериментального гострого пародонтиту їх вміст у сироватці крові перевищував показник здорових щурів у 2,2 раза, а в гомогенаті ясен – в 1,3 раза. До 8-ї доби концентрація ТБК-активних продуктів у сироватці крові суттєво знижувалась і становила 135 % від рівня інтактних тварин, а в гомогенаті ясен – 113 %. Моделювання гострого пародонтиту на тлі гіпотиреозу супроводжувалось менш суттєвим зростанням ТБК-активних продуктів. На 2-у добу від моменту нанесення травми їх рівень в гомогенаті ясен був у 1,2 раза нижчим у порівнянні з тваринами з нормальною функцією щитоподібної залози, в сироватці крові – в 2,1 раза. На 8-му добу експерименту значення ТБК-активних продуктів в гомогенаті ясен були нижчими на 14,5 %, в сироватці крові – на 25,9 % в порівнянні з тваринами, у яких запалення перебігало на фоні еутиреозу.
Зафіксовані нами зміни кінцевого продукту ліпопероксидації – шиффових основ підтверджують попередню тенденцію – моделювання патологічного процесу на тлі гіпотиреозу призвело до значно менших змін, ніж у еутиреоїдних тварин – відповідно 125 % і 119 % від норми.
Таким чином, результати наших досліджень, показують, що гіпотиреоїдні щури стійкіші до оксидативного стресу та тканинного пошкодження, ніж еутиреоїдні тварини.
Однак, як показали наші дослідження, гіпотиреоз супроводжується зниженням активності антиоксидантних ферментів І лінії захисту – СОД і каталази. Зокрема, у тварин, яким вводили мерказоліл супероксиддисмутазна активність крові була нижчою від показника інтактних тварин на 64 %, а в гомогенаті ясен – на 83 %. Каталазна активність також становила відповідно 81 і 75 % від норми. У тварин з гострим пародонтитом СОД крові на 2-у добу становила 114 %, гомогенату – 115 % від рівня здорових тварин. До 8-ї доби показники значно знижувались і склали 83 % в обох досліджуваних біологічних рідинах. Моделювання гострого пародонтиту на тлі гіпотиреозу супроводжувалось зниженням активності СОД вже з 2-ї доби після нанесення травми – у крові вона складала 78 %, у гомогенаті – 59 % від норми. До 8-ї доби зниження ензимної активності продовжувалось і вона склала відповідно 36 і 55 % від рівня інтактних тварин і майже не змінювалась порівняно з гіпотиреоїдними щурами.
Концентрація церулоплазміну у тварин з гострим пародонтитом становила 67 % від рівня інтактних тварин, а до 8-ї доби дещо зросла і склала 75 % від норми. У тварин, яким гострий пародонтит моделювали на тлі гіпотиреозу показник церулоплазміну був ще нижчим – на 2-удобу 62 %, на 8-му – 63 %.
Визначення ВГ в гемолізаті еритроцитів щурів з гіпотиреозом також виявило більш низькі його значення в порівнянні з інтактними тваринами – рівень склав 81 % від норми. Нанесення гострої травми еутиреоїдним тваринам призвело до зниження концентрації ВГ порівняно з інтактними тваринами на 17,6 %, а до
8-ї доби спостерігалось подальше падіння і показник склав 72,9 % від норми. У гемолізаті еритроцитів щурів з гострою травмою ясен спостерігали тенденцію до підвищення рівня глутатіону, і до 8-ї доби його рівень був вищим від вихідних значень на 20,2 %. Вміст ВГ в гомогенаті ясен у щурів з гіпотиреозом був нижчим на 29,1 % і на 16,9 % (на 2-у і 8-у доби після нанесення травми відповідно) у порівнянні з тваринами, у яких запалення тривало на тлі не зміненого гормонального фону. Концентрація ВГ в гемолізаті еритроцитів у цій групі була також більш низькою і склала на 2-у добу 60,7 %, на 8-у – 56,0 % від рівня еутиреоїдних тварин.