ЛОКОРЕГІОНАРНА ЕЛЕКТРОГІПЕРТЕРМІЯ В НЕОАД’ЮВАНТНОМУ ЛІКУВАННІ ПЕРВИННООПЕРАБЕЛЬНОГО РАКУ ПРЯМОЇ КИШКИ

Короткий зміст

Матеріали і методи дослідження. Обстежено 90 хворих на рак прямої кишки T2-4N0M0 (43 чоловіки (47,8 %) і 47 жінок (52,2 %)), середній вік 62,9±0,96 років, які перебували на лікуванні в абдомінальному відділенні Запорізького обласного клінічного онкологічного диспансеру з лютого 2004 р. до травня 2005 р. Діагноз встановлювався на базі синтезу клініко-інструментальних досліджень, включаючи клінічні, біохімічні дані, дані ректороманоскопії з передопераційною біопсією, іригоскопії, УЗД органів черевної порожнини та за очеревинного простору, трансректального  УЗД, рентгеноскопії органів грудної клітки. Діагноз раку прямої кишки був встановлений на підставі даних патогістологічного дослідження згідно до класифікації TNM, 2002. При цьому аденокарцинома з різним ступенем диференціювання виявлена  в усіх пацієнтів. У зв’язку з метою і задачами дослідження всі пацієнти розподілені на 2 групи. До основної групи увійшли 50 хворих (27 чоловіків і 23 жінки віком від 38 до 77 років, середній вік (62,8±1,29) року) на рак прямої кишки Т2-4N0M0,  яким було проведено комплексне лікування, що включало передопераційний курс дистанційної телегаматерапії на область прямої кишки (фракціями по 5 Гр щоденно до сумарної осередкової дози 20 Гр) з локорегіонарною електрогіпертермією (щоденно через 1 годину після опромінення протягом 60 хвилин за температурного режиму 45°С) та радикальне оперативне втручання наступної доби. Контрольну групу склали 40 пацієнтів (16 чоловіків і 24 жінки віком від 40 до 77 років, середній вік 63,2±1,5 року ) з раком прямої кишки T2-4N0M0, які отримали комплексне лікування за загальноприйнятою методикою - передопераційний курс дистанційної телегаматерапії на область прямої кишки протягом 4 діб (фракціями по 5 Гр щоденно до СОД 20 Гр) та радикальне оперативне втручання наступної доби. Усім хворим проводилося комплексне клінічне обстеження з урахуванням скарг, даних анамнезу, об’єктивних (огляд, пальпація, перкусія, аускультація, пальцеве дослідження прямої кишки) і додаткових (лабораторних та інструментальних) методів дослідження. Оперативні втручання проводилися згідно до принципів тотальної мезоректумектомії.

Патогістологічне дослідження проводилося двічі – до початку лікування (після біопсії) та після лікування (дослідження післяопераційного матеріалу). Гістологічний матеріал підлягав патогістологічному дослідженню. Біопсійний матеріал фіксувався у 10 %-ному розчині нейтрального формаліну, проводився через серію спиртів зі зростаючою концентрацією, заливався в парафін. Зрізи фарбувалися гематоксилін-еозином. Морфологічні дослідження проводилися на мікроскопі ERMA BINOCULAR MICROSCOPE MODEL YM-1 (Японія). Ступінь неоангіогенезу вивчали, досліджуючи маркер ендотелію судин CD34 та рецептор ендотеліального фактору росту 1 типу (VEGFR1) імуногістохімічним методом на базі діагностичного центру Дніпропетровської медичної академії. Як первинні антитіла використовувалися моноклональні антитіла  до VEGFR (клон KLT9, Novocastra), CD34 (клон QBEnd, DakoCytomation). У якості розчинника антитіл ми використовували фірмовий розчин ANTІBODY DІLUENT (DakoCytomation). Подальшу обробку проводили з використанням системи візуалізації LSAB2 (DakoCytomation) впродовж 10 хвилин з кожним реагентом з проміжним промиванням у ТРИС-буферному розчині. Після цього проводили реакцію з хромогеном (DAB (DakoCytomation)), оцінюючи якість взаємодії під контролем мікроскопу впродовж від 20 секунд до 3 хвилин. Результат оцінювали як позитивний при випаданні солей хромогену саме в клітинах ендотелію пухлин, при чому у вигляді специфічної реакції. Оцінка імуногістохімічної реакції ґрунтувалася на інтенсивності фарбування і розподілі імунопозитивних клітин. При оцінці імуногістохімічного забарвлення використовувався напівкількісний метод вивчення вираженості експресії маркерів VEGFR1 та CD34 у пухлині з 4 категоріями, привласнюючи відповідній реакції значення від „+” до „++++” або від 1 до 4 балів. Оцінка „+” привласнювалася невираженій реакції, „++” – слабке забарвлення (позитивно забарвлені окремі судини пухлинної строми або розповсюджена на всі стромальні судини, але слабка реакція), „+++” – помірно виражене забарвлення (більша кількість позитивно забарвлених судин) і „++++” – інтенсивне забарвлення (практично всі судини строми були позитивними). Локорегіонарна електрогіпертермія проводилася за допомогою апарату EHY 2000 13M Electrohyperthermia device, який отримав  сертифікат CE/MDD (європейський сертифікат на медичну апаратуру). Прилад призначений для неінвазивного лікування злоякісних пухлин. Селективність дії забезпечувалася різницею у величині комплексної діелектричної постійної (комплексному імпедансі) здорових і злоякісних тканин. До складу апарату входили аплікатори спеціальної конструкції (пацієнт був діелектриком у конденсаторі). EHY2000 13M автоматично виконував персоналізоване налаштування та керував процесом лікування, вимірюючи електричні параметри. Для спостереження за температурою у тканині використовували величини енергії, що поглинається та імпеданс. Встановлення аплікаторів базується на електродинамічних розрахунках. Параметри потужності апарату встановлювалися автоматично за допомогою блоку автоналаштування. Під час локорегіонарної електрогіпертермії використовували стандартний асиметричний електрод з водяним болюсом, який охолоджувався та водяну кушетку зі змонтованим у ній тримачем електроду і охолоджуючим блоком. Основним компонентом приладу був радіохвильовий модуль, який мав частоту на виході 13,56 МГц. Локальна температура у пухлині є розрахунковою величиною, що визначається з урахуванням вихідної потужності, частоти (13,56 МГц). Параметр температури виводився на дисплей і позначався як „еквівалентна  температура” – це еквівалентна статична температура, яка викликає процеси, що на поточний момент відбуваються у тканині, та визначає активність локальних змін у тканині.

Статистичний аналіз отриманих результатів проводили методом варіаційної статистики з використанням ліцензійного пакету програм “Statistica” (version 6.0, Stat Soft Inc, США). Розраховувались середнє значення (М), дисперсія, стандартне відхилення, медіана (m), вірогідність та рівень значущості (Р). Вірогідність відмінностей між вибірками підтверджувалася використанням U-критерію Уілкоксона-Манна-Уїтні. Для оцінки ступеню взаємозв’язку використовувався коефіцієнт кореляції (r) Спірмена.

Результати дослідження та їх обговорення. До однієї із складових частин дослідження входило вивчення особливостей патоморфологічних параметрів новоутворень пацієнтів основної та контрольної груп до та після комплексного лікування за відповідною схемою. Патогістологічне дослідження встановило відсутність вірогідних відмінностей у групах дослідження за такими показниками як категорії T, N, G, локалізацією первинної пухлини у відповідному відділі прямої кишки. За нашими даними під час аналізу розташування пухлини відносно відділів прямої кишки серед усіх пацієнтів, які брали участь у дослідженні, встановлено, що найчастіше пухлина була виявлена у середньоампулярному відділі – 42 (47 %) випадків. Нижньоампулярний відділ прямої кишки вражався у 32 (36 %) пацієнтів. Розташування первинної пухлини у верхньоампулярному відділі було у 16 (18 %) хворих. Під час аналізу ступеню місцевого розповсюдження Т серед усіх пацієнтів, які брали участь у дослідженні, встановлено, що найчастіше була визначена категорія Т3 – у 55 (61 %) випадків, категорія Т4 виявлена у 29  (32 %) випадків, категорія Т2 – у 6 (7 %) хворих. Серед усіх пацієнтів, які брали участь у дослідженні, найчастіше спостерігалася низькодиференційована аденокарцинома G3 – у 60 (66,7 %) хворих. Середньодиференційована аденокарцинома G2 виявлена у 24 (26,7 %) осіб, високодиференційована аденокарцинома G1 встановлена у 6 (6,7 %) пацієнтів.

Під час вивчення закономірностей частоти експресії маркерів VEGFR1 і CD34 в основній і контрольній групі, досліджувалися дані до початку комплексного лікування. Згідно до результатів дослідження не виявлено статистично значущої різниці за вище вказаними показниками до початку терапії. Так, показник експресії рецептору ендотеліального фактору росту 1 типу VEGFR1 у пацієнтів, які отримували локорегіонарну електрогіпертермію (основна група) становив 2,6, в той час коли у осіб контрольної групи він склав 2,5. Показник рівня експресії специфічного маркеру ендотелію CD34 серед хворих основної групи дослідження відповідав 2,8, а серед пацієнтів контрольної групи – 2,6. Встановлено, що частота та ступінь експресії VEGFR1 і CD34 не залежали від таких патоморфологічних параметрів, як категорія Т, G, локалізація первинної пухлини у пацієнтів обох груп дослідження.

Під час вивчення рівня експресії рецепторів ендотеліального фактору росту 1 типу (VEGFR1) до початку лікування серед усіх пацієнтів, які брали участь у дослідженні, встановлені наступні дані: найчастіше зустрічалася експресія VEGFR1 „+++” – у 38 хворих, що становить 42 %. Експресія VEGFR1 „++” спостерігалася у 26 (29 %) пацієнтів, „+” – у 13 (14 %) осіб, „++++” – у 13 (14 %) хворих. Під час аналізу експресії VEGFR1 після неоад’ювантної терапії серед усіх хворих, що брали участь у дослідженні, встановлено, що найчастіше зустрічалася експресія VEGFR1 на рівні „++”, яка була виявлена у 37 пацієнтів, що становить 41 %. Експресія VEGFR1 „+” спостерігалася у 32 (35,6 %) хворих, „+++” – у 18 (20 %) випадках, „++++” – у 3 (3 %) пацієнтів.

Під час дослідження вираженості експресії рецепторів ендотеліального фактору росту 1 типу (VEGFR1) до комплексного лікування окремо по групах дослідження встановлено, що серед пацієнтів основної групи (до схеми лікування включено локорегіонарну електрогіпертермію) рівень експресії VEGFR1 „+” спостерігався у 5 хворих (10 % від пацієнтів основної групи дослідження), „++” – у 15 (30 %) хворих, „+++” – у 23 (46 %) пацієнтів, „++++” – у 7 (14 %) хворих.  Після аналізу частоти експресії VEGFR1, яка досліджувалася після проведення комплексної терапії , у пацієнтів основної групи встановлено, що рівень експресії VEGFR1 „+” спостерігався у 25 хворих (50 % від пацієнтів основної групи дослідження), „++” – у 18 (36 %) хворих, „+++” – у 6 (12 %) пацієнтів, „++++” – у 1 (2 %) випадку. При порівнянні рівня експресії рецептору ендотеліального фактору росту 1 типу у пацієнтів основної групи дослідження до та після комплексної терапії встановлено, що частка хворих з експресією VEGFR1 на рівні „+” збільшилася з 10 % до 50 % (з 5 до 25 хворих), а частка хворих з експресією VEGFR1 на рівні „+++” зменшилася з 46 % до 12 % (з 23 до 6 хворих). Також зменшилася частота експресії VEGFR1 „++++” з 14 % до 2 % (з 7 до 1 випадку). Частка пацієнтів з експресією VEGFR1 „++” істотно не змінилася.

Під час дослідження вираженості експресії рецепторів ендотеліального фактору росту 1 типу VEGFR1 до комбінованого лікування серед пацієнтів контрольної групи  встановлено, що рівень експресії VEGFR1 „+” спостерігався у 8 хворих (20 % від пацієнтів контрольної групи дослідження), „++” – у 11 (27,5 %) хворих, „+++” – у 15 (37,5 %) пацієнтів, „++++” – у 6 (15 %) випадках. Після аналізу частоти експресії VEGFR1, яка досліджувалася після проведення комбінованої терапії, у пацієнтів контрольної групи встановлено, що рівень експресії VEGFR1 „+” спостерігався у 7 хворих (17,5 % від кількості пацієнтів контрольної групи), „++” – у 19 (47,5 %) хворих, „+++” – у 12 (30 %) пацієнтів, „++++” – у 2 (5 %) випадках.

Однією із задач нашого дослідження було встановлення та інтерпретація динаміки експресії маркерів неоангіогенезу при раку прямої кишки в залежності від отриманого передопераційного лікування, променевої терапії і променевої терапії з локорегіонарною електрогіпертермією. При порівнянні частоти розподілу хворих з відповідною експресією VEGFR1 в контрольній групі дослідження до та після проведеного лікування встановлено, що частота експресії VEGFR1 „++” збільшилася з 28 % до 47 % (з 11 до 19 випадків). Частота експресії VEGFR1 „+++” зменшилася з 37,5 % до 30 % (з 15 до 12 випадків). Також зменшилася частота експресії VEGFR1 „++++” з 15 % до 5 % (з 6 до 2 випадків). Частота експресії VEGFR1 „+” істотно не змінилася. При цьому у пацієнтів контрольної групи не встановлено статистично вірогідної різниці у показниках експресії VEGFR1 до та після лікування. При порівнянні рівня експресії рецептору ендотеліального фактору росту 1 типу у пацієнтів основної групи дослідження до та після комплексної терапії встановлено, що частка хворих з експресією VEGFR1 на рівні „+” збільшилася з 10 до 50 % (з 5 до 25 хворих), а частка хворих з експресією VEGFR1 на рівні „+++” зменшилася з 46 до 12 % (з 23 до 6 хворих). Також зменшилася частота експресії VEGFR1 „++++” з 14 % до 2 % (з 7 до 1 випадку). Частка пацієнтів з експресією VEGFR1 „++” істотно не змінилася. В той же час у хворих, які отримували передопераційну променеву терапію і локальну електрогіпертермію, відбулося зниження рівня експресії VEGFR1 після отриманого лікування з 2,6 до 1,7 балів (р<0,05) або на 34,6 %. Імуногістохімічна картина експресії VEGFR1 у пацієнта основної групи дослідження до та після проведеного лікування представлена на рис. 1, 2.