Матеріали і методи дослідження. В ДУ Інституті невідкладної і відновної хірургії ім. В.К.Гусака АМН України за період з 2002 по 2007рр. перебувало на лікуванні 208 пацієнтів з різними норицями шлунково-кишкового тракту. Нами використовувалася доповнена класифікація нориць за Віциним Б.А., 1950. Після дотримання критеріїв виключення (губоподібні нориці, нориці зі зв’язком з вільною черевною порожниною та нориці, що відкривалися в недреновані назовні абсцеси), у дослідження були включені 42 пацієнти з неповними трубчастими кишковими тонко- і товстокишковими норицями, основною тактикою ведення яких стало консервативне лікування. При цьому, в дослідження включалися пацієнти як з несформованими норицями - 28 (66,6%), так і з сформованими - 14 (33,3%).
Усі пацієнти, включені у дослідження, методом конвертів були розподілені на дві групи: основну (ОГ) - 21 пацієнт і групу порівняння (ГП) - 21 пацієнт.
У ГП ми застосовували загальноприйняту тактику лікування КН що полягає в корекції показників гомеостазу, захисті шкіри, відкритому веденні рани в 16 спостереженнях (76,1%) у поєднанні з активною аспірацією хімусу. У 5 випадках (23,8%) нами використовувалися обтуратори. За необхідності проводився розтин набряків і неадекватно дренованих норицевих кишень.
У ОГ нами було використано оригінальну методику, що включає окрім загальноприйнятих методів консервативного лікування використання фібробластно-колагенового композиту (ФКК) (Деклараційній патент на корисну модель № 5212 від 15.02.2005р. «Спосіб лікування норицевої хвороби»).
За основними критеріями (стать, вік, етіологія норицеутворення, локалізація нориці, початковий дебіт, сформованість норіцевго ходу, наявність та кількість ускладнень, загальний стан пацієнтів) нами не зафіксовано принципових відмінностей у характеристиках пацієнтів і безпосередньо в характері норицевого дефекту. Отже було зроблено висновок, що групи репрезентативні.
Матеріал для виготовлення ФКК отримувався при плановому перериванні вагітності за соціальними показаннями у здорових жінок у стерильних умовах операційної гінекологічного відділення ІНВХ ім. В.К.Гусака АМНУ при термінах гестації не пізніше 10 тижнів. Забір виконувався відповідно до Наказу Міністерства охорони здоров'я України № 226 від 25.09.2000 р. та інструкції (z0701/00) «Перелік анатомічних утворень, тканин, їх компонентів і фрагментів і фетальних матеріалів, дозволених до вилучення у донора трупа і мертвого плоду людини» частина 5. Транспортування матеріалів проводилося медичним персоналом відповідно до Наказу Міністерства охорони здоров'я України № 226 від 25.09.2000 р. та інструкції (z0703/00) «Умови забезпечення збереження анатомічних матеріалів при їх перевезенні» частина 2. Паралельно із забором абортивного матеріалу проводився забір крові на визначення антитіл до ВІЛ, сифілісу, гепатитам В і С, цитомегаловирусу (перелік обов'язкових вірусологічних обстежень відповідно до наказу Міністерства охорони здоров'я № 1007-XIV), а також до групи урогенітальних інфекцій і папіломавірусу. При цьому оформлялася окрема письмова згода на проведення вірусологічних тестів. Вірусологічні дослідження проводилися у сертифікованій, адміністративно незалежній лабораторії обласного Центру з боротьби і профілактики СНІДу м. Донецька.
Основними лабораторними етапами приготування ФКК були дезагрегація фетального матеріалу, отримання первинної культури фібробластів, культивування, кріопрезервування і виготовлення ФКК. Як засоби доставки використовуються одноразові шприці об'ємом 5 або 10 мл.
У кожному конкретному випадку, відповідно до анатомічних особливостей норицевого ходу, підбирали об'єм ФКК. Оптимальним варіантом є повне заповнення норицевого ходу (до появи зворотного струму гелю). Технічно застосування ФКК досить просте і полягає в інжекції з шприца гельовидної маси. Процедури повторювали 1 раз на три доби, не більше 4 ведень. Якщо нориця не закривалася – встановлювали показання для оперативного закриття нориці.
Усім хворим із норицями на етапах лікування проводили комплекс досліджень: клінічних; антропометричних; фізикальних; лабораторних. Доопераційну діагностику нориць проводили за допомогою рентгенологічних досліджень, комп'ютерної томографії, ультразвукового та ендоскопічного дослідження. У 36 (85,7%) хворих із зовнішніми норицями ШКТ протягом першої доби проводили фістулографію та у 100% пацієнтів - пробу за Напалковим П.Н., 1940р.
Ендогенну інтоксикацію визначали на підставі критеріїв, розроблених В.А. Корячкіним і В.І. Страшновим (2002), які виділяють 3 стадії: реактивно-токсичну, вираженої токсемії і мультиорганної дисфункції.
Результати лікування оцінювалися за такими критеріями:
· динаміка скорочення дебіту;
· динаміка зменшення об'єму норицевого ходу за даними фістулографії;
· швидкість проліферації грануляційної тканини;
· терміни переходу несформованої нориці у сформовану;
· необхідність переходу до хірургічної тактики;
· терміни закриття нориці.
Оцінку результатів лікування хворих з норицями проводили за наступною шкалою:
· відмінний результат - остаточне закриття нориці без розвитку ускладнень;
· добрий результат - усунення норицевого пасажу за наявності залишкового норицевого ходу і відсутність ускладнень;
· задовільний - усунення норицевого пасажу за наявності залишкового норицевого ходу, але з наявністю некупірованих ускладнень на момент закінчення обраного терміну спостереження;
· незадовільний – необхідність переходу на хірургічну тактику ведення нориці або летальний результат.
Нами проведено порівняльне морфологічне вивчення фрагментів стінок норицевого каналу з використанням загальногістологічних, гістохімічних й імуногістохімічних методик дослідження. Предметом вивчення були шматочки грануляційної тканини із норицевого ходу в процесі лікування у 12 хворих із загальновідомою тактикою ведення норицевого дефекту (ГП) і у 12 хворих у поєднанні із застосуванням культури алофібробластів (ОГ).
Фрагменти грануляційної тканини із нориць (всі біопсії проведено з відому хворих), фіксували в нейтральному забуферному формаліні (pH 7,4) протягом 24 годин. Після дегідратації шматочки заливали в парафін за стандартною методикою. На ротаційному мікротомі Microm HM325 з системою перенесення зрізів STS (Carl Zeiss, Німеччина) виготовляли серійні гістологічні зрізи товщиною 5 мкм, які потім забарвлювали гематоксиліном і еозином, по Ван Гізону, по Вергофу, толуїдиновим синім при рН 2,6 і 5,3, ставили ШІК-реакцію з обробкою контрольних зрізів амілазою.
Частину серійних гістологічних зрізів поміщали на покриті адгезивом стекла Super Frost Plus (Menzel, Німеччина) для імуногістохімічного дослідження. Для «демаскування» антигенів регідратовані зрізи піддавали термічній обробці в розчині Target Retrieval Solution (DAKO, Данія) з використанням водяної випарної лазні GFL 1023. Після блокування неспецифічного скріплення білків протеїновим блоком (DAKO) і ендогенної пероксидазної активності пероксидазним блоком (DAKO) наносили первинні антитіла. Для виявлення фібробластів використовували мишачі моноклональні антитіла (МАТ) до віментину (клон Vim 3V4, DAKO), актину (клон HHF35, DAKO), для типувания клітин інфільтратів використовували МАТ до CD4 (Т-хелпери) (клон 1F6, Novocastra), CD8 (Т-супресори) (клон 1A5, Novocastra), CD68 (макрофаги) (клон PG-M1, DAKO). Також проводилася детекція ядерного маркера проліферації Ki67. Візуалізацію первинних антитіл проводили за допомогою полімерної системи детекції DAKO En Vision+. Як субстрат для пероксидази хріну використовували DAB+ (DAKO). Препарати дофарбовували гематоксиліном Майера. Далі забарвлені зрізи укладали в напівсинтетичне середовище Permanent Mounting Medium (DAKO).
Мікроскопію препаратів проводили на мікроскопі Olympus AX70 Provis (Olympus, Японія) за допомогою програми аналізу зображення Analysis 3.2 Pro (Soft Imaging, Німеччина) згідно рекомендаціям виробника програмного забезпечення. Морфологічне вивчення морфогенезу загоєння нориць проведене автором у співпраці зі співробітниками патоморфологічного відділу лабораторії фундаментальних досліджень ДУ «ІНВХ ім. В.К. Гусака АМНУ» (зав. лабораторією – доц. А.М. Гнилорибов).
Цитологічні відбитки отримували за модифікованою методикою М.С. Макарова – М.П. Покровської (Быков В.Л.,2002р.). Цервікальною щіткою виконували зіскоб із стінок норицевого каналу. Препарати висушували на повітрі і фіксували 15-20 хвилин у суміші Никифорова. Цитологічні препарати забарвлювали фарбником Романовського у звичайному прописі. Цитологічна частина дослідження проведена в лабораторії фундаментальних досліджень ДУ «ІНВХ ім. В.К. Гусака АМНУ» (зав. лабораторією – доц. А.М. Гнилорибов).
Тип цитограм ранового відбитку оцінювали за класифікацією М.В. Камаєва, доповненою розділом, що описує ознаки аутоімунних порушень у рані (Полонская Н.Ю., 2005).
Цифрові дані, визначені в результаті досліджень, пройшли комп'ютерну обробку на персональному комп'ютері з програмами “Excel 7,0”, “Statistica 6.0” фірм StatSoft. При цьому визначався довірчий інтервал і стандартне відхилення генеральної сукупності для рядів даних. Міра достовірності відмінностей середніх величин у зіставлюваних групах визначалася шляхом використання критеріїв Стьюдента і Фішера. Для характеристики взаємозв'язків між певними параметрами використовували підрахунок лінійної кореляції (критерій Пірсона) і складали рівняння лінійної і нелінійної регресії. Відмінності вважали статистично за значущі при вірогідності безпомилкового прогнозу P= 95% і більше.
Результати власних досліджень та їх аналіз. Кількість виділюваного, що виділяється із зовнішнього норицевого отвору, взагалі не є однорідним за своїм походженням. Основний об'єм формується за рахунок кишкового хімусу, кількість якого залежить, у свою чергу, від цілої низки причин. Тому об'єм виділюваного характеризує, до певної міри, як динаміку контракції дефекту кишкової стінки, так і ступінь запальних змін безпосередньо в норицевому каналі. Достатньо великий розкид початкових цифрових значень по дебіту нориці не дав об'єктивної інформації з аналізу масиву значень, тому нами було визначено середні показники дебіту в обох групах.
Швидкість зміни середніх значень норицевого дебіту максимально розрізнялася на початкових етапах лікування. До результату третьої доби від початку застосування ФКК в основній групі середня кількість відокремлюваного була 256,2мл./добу, а в ГП - 392,9мл./добу, тобто достовірно меншою у 1,4 рази. На шосту добу це співвідношення складало 1,27, а починаючи з дев'ятої доби лікування практично вирівнювалося і не перевищувало 1%. Наші дані показують достовірне зменшення норицевого виділюваного в ОГ, де було використано цілеспрямовану стимуляцію формування грануляційної тканини норицевого ходу.
Отримані нами фактичні дані підтвердили динамічнішу зміну об'єму норицевого ходу в групі пацієнтів, до яких було застосовано ФКК. Проте тут спостерігалася зворотна тимчасова залежність – максимальна різниця значень виявлена на пізніших термінах лікування. Так, якщо на початку лікування (на 3 добу) середній обєм норицевого ходу в ОГ (14,8мл.) був менше середнього об'єму в ГП (12,3мл.) всього в 1,15 разів, то на 12 добу це співвідношення дорівнювало 1,53 разів, а на 15 добу середній об'єм в ОГ (1,2мл.) був менше середнього об'єму в ГП (2,6мл.) у 2,0 рази.
Загоєння трубчастих нориць відбувається за рахунок проліферації мезенхіми з поступовим роз'єднанням спряжених просторів. Кінцевим етапом є формування сполучнотканинного рубця, який у подальшому може епітелізуватися. У зв'язку з розумінням цих механізмів, одним з основних критеріїв визначення патогенетичної ефективності запропонованого лікувального підходу, стали морфологічні дослідження. Нами використані як гістологічні, так і цитологічні методики.
Початково, практично в 100% спостережень, цитологічне дослідження зафіксувало некротичний (72,4%) або дегенеративно-запальний (27,6%) тип клітинної реакції. При цьому цитологічна картина відрізнялася мозаїчністю. Слід зазначити, що запально-регенеративний тип мазка був напочатку виявлений у переважній кількості випадків (83,3%) у пацієнтів зі сформованими норицями.
На 3 добу лікування нами було виявлено запальну реакцію клітинних популяцій, яка більш маніфестно була присутньою в ОГ спостережень. Уже на 6 добу виявлялися достатньо істотні відмінності у складі мазків у пацієнтів з використаним ФКК у бік ранніх проявів фібропластичної реакції і стихання ознак неспецифічної запальної реакції. У деяких випадках на 6 добу, і в переважній більшості препаратів, отриманих на 9 добу, в ОГ виявлявся регераторно-запальний тип цитограм, що означає початкову стадію активної репарації і перевагу проліферації клітинних елементів над альтернативними процесами у стінці норицевого ходу.
Тільки на дев'яту добу у пацієнтів ГП зареєстровано переважно регенеративно-запальний тип клітинної ранової реакції. В ОГ виявлявся граничний стан між запально-регенераторним і регенераторним типом, що, на нашу думку, може бути доказом безповоротності проліферативних процесів.
Проте на 12 добу спостереження нами в обох групах відмічено регенераторний тип цитограм. Таке зближення результатів ми пояснюємо тим, що на 12 добу цитологічні мазки було взято у пацієнтів ОГ, у яких нориці до цього моменту ще продовжували функціонувати. Тобто забір проведений у найбільш резистентних до лікування пацієнтів. Проте, не дивлячись на це, ступінь виразності регенеративних процесів був більше виражений в ОГ.
На п'ятнадцяту добу в обох групах цитологічну картину можна трактувати як регенеративно-запальний тип цитограм, з деякою тенденцією до регенеративного типу. Забір матеріалу проведено у 4 пацієнтів ГП і у 2 в ОГ, оскільки у решти хворих норицевий хід закрився. Таким чином, по суті, цитологічні дані в цей термін спостереження відображають ту ситуацію, коли як загальноприйняте місцеве лікування норицевого ходу, так і запропоноване нами, не дало позитивного ефекту. Це підтверджує не абсолютність консервативних методів лікування норицевої хвороби і обґрунтованість хірургічної тактики у разі неефективності менш травматичних способів лікування.
Дані цитологічного моніторингу підтверджують, що в ОГ має місце коротший альтеративний і дегенеративний періоди, менш виражена запальна реакція, а також прискорені процеси проліферації і диференціювання мезенхімальних клітинних пулів порівняно з ГП.
На момент початку лікування, що практично завжди збігалося з фактом утворення нориці, зміни, виявлені нами в гістологічних препаратах, були ідентичними для обох груп спостереження. Основним був некротичний і запальний компонент.
Наявність у складі клітинного інфільтрату як Т- так і В-лімфоцитів свідчить про достатню напруженість і клітинної, і гуморальної ланок імунітету. При цьому збільшення популяції нейтрофільних ПЯЛ є віддзеркаленням різкого пригнічення клітинної ланки імунітету, зниженням функції мононуклеарів, що беруть участь у розвитку гнійно-некротичних фагоцитуючих ускладнень.
При дослідженні гістологічних препаратів, отриманих зі стінок норицевого ходу у пацієнтів ГП, нами відзначено поступове стихання альтеративних процесів і паралельні відновні (репаративні і регенеративні) зміни в тканинах.
На 6 - 9 добу після початку місцевого лікування нейтрофільна інфільтрація стабілізується, має місце збільшення числа макрофагів і молодих фібробластичних елементів. У цей період відбувається формування грануляційної тканини. Не дивлячись на те, що питомий об'єм змішаної нейтрофільно-мононуклеарної інфільтрації значно зростає до кінця 9 доби від початку лікування, число активно фагоцитуючих клітин, що включають ПЯЛ зі збереженою цитологічною структурою, а також макрофаги, позитивно типовані МАТ до антигену CD68, виявляється в невеликій кількості в ГП.
Уже починаючи з 6 доби, у препаратах ОГ відзначено підвищення проліферативної активності клітин фібробластного ряду. На 12 добу відбувалося вирівнювання питомої ваги судинної мережі і стромального компоненту. На 12 добу починалося відкладання колагену, з формуванням колагенових волокон. У таких ділянках колагенові волокна були слабко ШІК-позитивні, переважно пікринофільні при забарвленні по Ван Гізону.
Новоутворення капілярних бростей і судинних відзначається в ОГ вже до кінця 6 доби після використання ФКК. Інтенсивність їх формування в перші 14 діб збігається з інтенсивністю наростання щільності фагоцитуючих мікро- і макрофагів. З особливостей формування грануляційної тканини в цій групі спостережень, слід зазначити, що вже на 6 добу периваскулярно разом з макрофагами виявляються фібробластичні елементи різного ступеня диференціювання – від епітеліоїдних до фібробластів з морфологічними ознаками високої функціональної активності.
При проведенні імуногістохімічного фарбування з антитілами до Ki67 позитивне фарбування виявлене вже на 3 добу в периваскулярних зонах. Інтенсивність детекції проліферируючих клітин поступово наростала на 9 добу, а потім відбувалося зменшення детекції Ki67 у периваскулярній зоні. Периваскулярно мінімальний рівень відзначений на 12 добу спостереження. Значно раніше, вже на 6 добу, на фоні все ще збереженої периваскулярної детекції Ki67, відзначалося посилення детекції Ki67 у стромальній зоні. Рівень підвищеної детекції мітотичної активності стромального компоненту зберігався на високому рівні до остаточного закриття норицевого ходу.
Таким чином, темп стихання запального і початку репаративно-резорбтивних процесів у норицевому каналі у пацієнтів ОГ, яким у комплексному лікуванні було використано алогенний ФКК, був вищим, ніж у хворих ГП. Нами відзначено сприятливу динаміку репаративних процесів з безперечним їх домінуванням над альтеративно-запальними процесами. На нашу думку, це пов'язано з тим, що використання культури алогенних фібробластів створює оптимальні умови для зростання грануляції. Крім того, фібробласти надають стимулюючий ефект за допомогою виділення біологічно активних речовин і чинників зростання.
Під впливом загальновідомих способів місцевого ведення нориць, у поєднанні з системною корекцією гомеостазу, у ГП нам вдалося на 15 добу перевести 6 нориць у сформовані (46,1% з початково несформованих). В ОГ цей показник дорівнював 80,0% з початково несформованих нориць (12 хворих). Таким чином, в ОГ цей показник покращав майже в 1,7 разів.
В обох групах ми не відзначили достовірної залежності трансформації нориці у сформовану від дебіту кишкового виділюваного і об'єму нориці. Певна закономірність простежувалася при зіставленні даних про початкову тяжкість загального стану пацієнтів і ступеня інтоксикації.
Середні терміни переходу нориці у сформовану в ГП склали 12,4±1,0 доби, а в ОГ - 9,8±1,3 доби. Швидкість переходу несформованих нориць у сформовані зросла в 1,3 разів.
Під впливом комплексного лікування, нам повністю не вдалося купірувати всі ускладнення несформованих нориць в обраний період спостереження. Проте по групах змінилася їх кількість і якісний склад. У ГП загальна кількість ускладнень знизилася з 22 до 9 (у 2,4 разів). В ОГ загальна кількість ускладнень знизилася з 26 до 4 (у 6,5 разів). Таким чином, в ОГ вдалося знизити кількість ускладнень порівняно з ГП у 2,7 разу. При цьому, як в ОГ, так і в ГП були повністю (100,0%) купіровані явища резидуального перитоніту і припинено абсцеси черевної порожнини. Найбільш резистентною виявилася мацерація шкіри в обох групах.
На 15 добу консервативного лікування, у цілому в 11 (26,2% від загального числа хворих) були показання до виконання хірургічної допомоги із закриття нориці. До основних показань ми відносимо сам факт наявності несформованої нориці протягом більше двох тижнів, що супроводжується втратою хімусу в об'ємі більше 500 мл. на добу і прогресія (виникнення) хоч би одного з ускладнень норицевої хвороби. Детально аспекти хірургічного лікування пацієнтів у цій роботі не розглядаються. У ГП було ухвалено рішення про зміну консервативної тактики ведення нориці на оперативну у 7 пацієнтів (33,3%). У всіх цих пацієнтів нориця мала характер несформованої. В ОГ на 15 добу лікування, тільки у 4 хворих було прийнято вимушене рішення про зміну тактики лікування на оперативну (19,0%). Таким чином, в ОГ вдалося в 1,7 разів знизити показання до оперативного лікування, або іншими словами – підвищити ефективність консервативного лікування несформованих нориць.
У ГП в середньому (при сформованих і несформованих норицях) нами було зареєстровано загоєння нориці (якщо воно відбувалося) на 13,4±1,7 доби. В ОГ загоєння нориці в середньому наступало (при сформованих і несформованих норицях) на 10,5±0,9 доби. Скорочення термінів склало 2,9±0,8 доби.
На 15 добу спостереження в ГП не тільки припинився дебіт, але і повністю епітелізувався норицевий хід тільки у 2 пацієнтів з несформованими норицями (15,4%). В ОГ аналогічного результату вдалося досягти у 8 хворих (53,3%). Поліпшення показника склало 37,9% або в 3,5 разу.
Загальна тактика ведення пацієнтів зі сформованими норицями полягала у спробі консервативного закриття норицевого дефекту. Якщо до кінця другого тижня лікування нориця не закривалася – виставлялися показання до планового оперативного лікування. У цілому, при використанні консервативної тактики нам вдалося досягти певних позитивних результатів у всіх пацієнтів, включених в дослідження. Проте ми відзначили дисонанс у «надійності» і ступеня вирішення проблеми. У ГП був відзначений випадок, коли нориця рецидивувала після 15 діб спостереження, не дивлячись на те, що в досліджуваний період припинився дебіт хімусу по нориці. У ГП відносно надійне загоєння у цієї категорії пацієнтів відбулося у 50,0% пацієнтів. У ті ж терміни нориця як така в ОГ загоїлась у 66,6% випадків (поліпшення показника на 16,6% або в 1,3 разів).
У пацієнтів з сформованими норицями, до закінчення термінів спостереження фіксувалися залишкові ускладнення, кількість і тяжкість яких були меншим в ОГ. У цілому, загальна кількість ускладнень у ГП знизилася в 2,7 разів. У ОГ кількість ускладнень знизилася в 5 разів. Таким чином, зменшення кількості ускладнень у хворих в ОГ зі сформованими норицями, порівняно з ГП склало 1,8 разів.
Кінцеві терміни загоєння сформованих нориць у ГП в середньому склали 12,4±1,6 доби. В ОГ, в середньому, загоєння нориці наступало на 9,2±0,6 доби. Скорочення термінів лікування склало 3,2±1,0 доби.
У ГП в середньому (при сформованих і несформованих норицях) нами було зареєстровано загоєння нориці (якщо воно відбувалося) на 13,0±1,6 доби. В ОГ загоєння нориці в середньому наступало (при сформованих і несформованих норицях) на 10,1±0,8 доби. Скорочення термінів склало 2,9±0,8 доби. | 
