Характеристика систем рестрикции-модификации II типа в коллекции природных штаммов семейства Enterobacteria-ceae и рода Pseudomonas Перцев, Александр Владимирович

Короткий опис

Перцев,АлександрВладимирович.Характеристикасистемрестрикции-модификацииIIтипавколлекцииприродныхштаммовсемействаEnterobacteria-ceaeиродаPseudomonas: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04. - Пущино, 1998. - 179 с.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ и ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ им. Г.К.СКРЯБИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК на правах рукописи УДК 577.152.3; 577.152.312'14ПЕРЦЕВАЛЕКСАНДРВЛАДИМИРОВИЧХАРАКТЕРИСТИКАСИСТЕМРЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКМ^ИИ IIТИПАВКОЛЛЕКЦИИПРИРОДНЫХШТАММОВСЕМЕЙСТВАENTEROBACTERIACEAE ИРОДАPSEUDOMONAS03.

стр. 2
Классификация ферментовсистемырестрикции-модификацииI I . 4. Изомеры 1.1.5. Ферментысистемырестрикции-модификацииIтипа1.1.6. Ферментысистемырестрикции-модификацииIIтипа1.1.6.1.Системырестрикции-модификации11-8 субкласса 1.1.6.2.Системырестрикции-модификацииП-Е субкласса 1.1.7.Системырестрикции-модификацииШ-готипаГ 1.7....

стр. 9
нами решались следующие задачи: 1. Провести поиск, очистку и идентификацию эндонуклеазрестрикции, относящихся ксистемамрестрикции-модификацииIIтипавколлекцииприродныхштаммовсемействаEnterobacteriaceae иродаPseudomonas. 2. Провести исследования локализации генов обнаруженныхсистем. 3. Провести сравнительный анализ плазмид, несущих генысистемырестрикции-модификацииII...

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Перцев, Александр Владимирович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Системы рестрикции-модификации прокариот.
1.1.1. Явление рестрикции-модификации.
1.1.2. Номенклатура сайт-специфических эндонуклеаз и ДНК-метилтрансфераз.
1.1.3. Классификация ферментов системы рестрикции-модификации.
1.1.4. Изомеры.
1.1.5. Ферменты системы рестрикции-модификации I типа.
1.1.6. Ферменты системы рестрикции-модификации II типа.
1.1.6.1. Системы рестрикции-модификации Н-Б субкласса.
1.1.6.2. Системы рестрикции-модификации Н-Е субкласса.
1.1.7. Системы рестрикции-модификации Ш-го типа.
1.1.7. Системы рестрикции-модификации ГУ-го типа.
1.1.8. Молекулярная организация систем рестрикции-модификации.
1.1.9. Распространение систем рестрикции-модификации.
1.1.10. Выделение и очистка ферментов рестрикции-модификации.
1.1.10.1. Разделение нуклеиновых кислот и сайт-специфических эндонуклеаз.
1.1.10.2. Очистка ферментов рестрикции-модификации.
1.1.11. Некоторые физико-химические и энзиматические свойства сайт-специфических эндонуклеаз и ДНК-метилтрансфераз.
1.1.11.1. Физико-химические свойства.
1.1.11.2. Влияние различных факторов на активность эндонуклеаз рестрикции.
1.2. Непарные ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции.
1.3. Метилирование ДНК эукариот.
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
II. 1. Материалы.
II. 1.1. Штаммы бактерий, бактериофаги, фаговые и плазмидные вектора.
II. 1.2. Среды и основные буферы.
II. 1.3. Материалы и реактивы.
И.2. Методы исследования.
Н.2.1. Поиск штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз.
И.2.2. Получение бактериальной биомассы.
II.2.3. Выделение плазмидной ДНК.
11.2.3.1. Лизис кипячением.
11.2.3.2. Выделение гшазмид по методу Кадо и Лю.
11.2.3.3. Лизис щелочью.
11.2.3.4. Очистка ДНК в градиенте хлористого цезия.
И.2.3.5. Удаление примесей РНК из препарата ДНК.
IL2.4. Получение препаратов фагов /„vir, /х[857 и
II.2.5. Выделение ДНК фагов Хс1857 и cp80vir.
И.2.6. Периодическое культивирование штаммов.
И.2.7. Очистка обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз.
11.2.8. Определение ферментативной активности сайт-специфических эндонуклеаз.
11.2.9. Определение сайта узнавания и места расщепления фосфодиэфирной связи на субстратной ДНК, обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз.
И.2.10. Определение оптимальных условий реакции для обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз.
11.2.11. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация.
11.2.12. Перенос плазмидной ДНК при помощи конъюгации.
11.2.13. Определение локализации генов, обнаруженных систем рестрикции-модификации.
И.2.14. Гибридизация плазмидных ДНК.
II.2.15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
И.2.16. Скрининг рекомбинантных клонов.
11.2.17. Препаративное выделение фрагментов ДНК.
11.2.18. Лигирование фрагментов ДНК.
11.2.19. Фосфорилирование олигонуклеотидных праймеров полинуклеотид-киназой фага Т4.
11.2.20. Клонирование гена эндонуклеазы R'Eco29)d.
11.2.21. Клонирование гена эндонуклеазы R'£co29kI-N6His.
11.2.22. Клонирование гена ДНК-метилтрансферазы M'£co29kI.7В
11.2.23. Экспрессия гена эндонуклеазы R'£co29kI.
11.2.24. Экспрессия гена эндонуклеазы R'£co29kI-N6His.
11.2.25. Экспрессия гена ДНК-метилтрансферазы M'£co29kI.
11.2.26. Очистка эндонуклеазы рестрикции Есо29к до гомогенного состояния.
И.2.27. Очистка эндонуклеазы рестрикции R'£co29kI-N6His до гомогенного состояния.
И.2.28. Электрофорез ДНК и белков.
11.2.29. Определение молекулярного веса R'£co29kI.
11.2.30. Определение молекулярного веса M'£co29kI.
11.2.31. Определение концентрации белка.
11.2.32. Определение активности ДНК-метилтрансферазы M°£co29kI.
11.2.33. Статистическая обработка полученных данных.
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
III. 1. Поиск, очистка, идентификация и локализация генов систем рестрикция-модификация в штаммах семейства Enterobacteriaceae и рода Pseudomonas.
III. 1.1. Поиск сайт-специфических эндонуклеаз.
III. 1.2. Очистка и идентификация эндонуклеаз рестрикции, обнаруженных в штаммах P. aeruginosa: новый подход к выделению и очистке эндонуклеаз рестрикции.
III. 1.3. Очистка и идентификация эндонуклеаз рестрикции, обнаруженных в штаммах семейства Enterobacteriaceae.
III. 1.4. Локализация генов систем рестрикции-модификации II типа в обнаруженных штаммах-продуцентах.
III.2. Рестрикционное картирование природной плазмиды рЕС и клонирование генов системы рестрикции-модификации Есо29к1.
111.2.1. Рестрикционное картирование плазмиды рЕС029.
111.2.2. Получение штамма-продуцента с увеличенным биосинтезом сайт-специфической эндонуклеазы R2?co29kI.
111.2.3. Создание штаммов-продуцентов с регулируемым уровнем экспрессии ферментов системы рестрикции-модификации Есо29к.
III. 3. Синтез эндонуклеазы рестрикции Eco29kJ клетками штамма
E. coli К802 [рЕС029А15] в условиях периодического культивирования на различных питательных средах.
111.4. Выделение и очистка до гомогенного состояния эндонуклеазы рестрикции R £co29kI и некоторые ее свойства.
111.5. Очистка эндонуклеазы R £co29kI-N6His.
ВЫВОДЫ.