ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ

Короткий зміст

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на кафедрі загальної та клінічної патологічної фізіології ОДМУ із дотриманням вимог положення «Європейської конвекції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» [Страсбург, 1985]. Комісією ОДМУ МОЗ України з питань біоетики (протокол № 43 Б від 5 жовтня 2007 р.) порушень у проведені дослідів на тваринах не виявлено.

Для вивчення вікових особливостей функціональної діяльності нирок відбирали білих безпородних щурів з масою тіла 40–470 г. Щурів залежно від віку розподілили на три групи: 1 група (n=10) — статевонезрілі (вік тварин 1-1,5 міс); 2 група (n=10) — молоді статевозрілі (вік тварин 3-3,5 міс); 3 група (n=10) — щури старшого віку (вік тварин 16-18 міс). Функціональну діяльність нирок вивчали в умовах водного і сольового навантаження (3 % розчин хлориду натрію).

Дослідження хронізації токсичної нефропатії проводили на білих безпородних щурах-самцях з масою тіла 100–290 г. Розчин дихлориду ртуті приготовлений на фізрозчині, був уведений 124 тваринам підшкірно у дозі 0,4 мг/100 г маси тіла, 120 тварин служили контролем, яким вводили відповідну кількість фізрзочину. Дослідну групу тварин шляхом довільного відбору поділили на дві підгрупи. Першу підгрупу (56 щурів) утримували на стандартному (нормонатрієвому) раціоні харчування. Другу підгрупу (68 щурів) утримували на гіпернатрієвому раціоні, тобто випоювали 0,8 % розчином натрію хлориду (осмоляльність розчину 275 мосмоль/кг Н₂О). Контрольну групу тварин поділили за аналогічним принципом, вони утворили третю і четверту підгрупи. До III підгрупи входило 69 щурів (нормонатрієва дієта), а  IV підгрупа складалася з 71 щура (гіпернатрієва дієта). Експеримент тривав протягом 100 днів. Через 3 і 7 діб після початку досліду було виконане водне навантаження щурам III і IV підгруп, а також відібрані тварини з усіх підгруп для проведення морфологічних досліджень (з I і II підгруп по 5 тварин). Згодом через 30, 60, 90 і 100 діб тваринам усіх чотирьох підгруп проводили водне навантаження з метою вивчення функції нирок в умовах індукованого діурезу. Водопровідну воду вводили внутрішньошлунково зондом із розрахунку 5 % від маси тіла. Потім щурів поміщали в обмінні клітки, сечу збирали протягом наступних 2 год.

Для проведення низки досліджень із метою вивчення ролі оксиду азоту в регуляції функціональної діяльності нирок щурів відбирали безпородних білих самців з масою тіла 140–180 г. Неселективний блокатор NO-синтаз N^щ-NLA («Sigma», США) (1 мг/100 г маси тіла) вводили за 30 хв до функціональної проби. Діяльність нирок вивчали в умовах 5 % навантаження водою (n=18) або 3 % розчином хлориду натрію (n=15) [Пахмурний Б. А., 1969; Берхін Е. Б., Іванов Ю. І., 1972]. Щурам контрольної групи (по 20 тварин в умовах навантаження водою і сольовим розчином) вводили еквівалентний об’єм води, що не містила блокатора.

З метою вивчення впливу малих доз нітриту натрію на діяльність нирок щурів для участі в експерименті відбирали безпородних білих щурів-самців з масою тіла 130–170 г. Тварини контрольної групи (n=15) протягом 10 діб як корм отримували зерно при вільному доступі до води. Щурів експериментальної групи утримували в аналогічних умовах, однак замість води тварини (n=10) протягом 10 діб вживали водний розчин нітриту натрію концентрацією 20 мг/л. Для приготування розчину використовувався хімічно чистий нітрит натрію виробництва фірми Acros organics (США). На 11-ту добу експерименту функціональний стан нирок тварин вивчали в умовах 5 % водного навантаження.

Для отримання крові тварин декапітували під легкою ефірною анестезією. Кров стабілізували гепарином фірми «Біолек» (Україна), центрифугували 15 хв при 3000 об/хв. Плазму крові відбирали для подальших досліджень. Вимірювали об’єм діурезу, потім розраховували його з урахуванням маси тіла тварин.

Вивчався вплив нормо- і гіпернатрієвого раціону, а також функціонального водного навантаження на структурні особливості  ниркової паренхіми як в інтактних тварин, так і у щурів, що отримували дихлорид ртуті.

Для проведення морфологічних досліджень у щурів вилучали праву нирку і фіксували в 10 % нейтральному формаліну. Фіксований матеріал заливали у парафін за загальноприйнятою методикою [Хватов Б. П., Шаповалов Ю. М., 1969]. З парафінових блоків виготовляли зрізи завтовшки 3-5 мкм, частину зрізів забарвлювали гематоксилін-еозином, для решти ставили реакцію Ван-Гізона [Шереметьєва Г. Ф., Кочарян Є. З., 1995]. Результати використаних методів оцінювали за допомогою світлового мікроскопа «Лійка» (США).

Морфометричні виміри проводили за допомогою програми «Olympus DP-Soft 3.2» (США) на мікроскопі «Olympus СХ-41» (США). Вимірювали у полі зору (426,24Ч628,24 мкм) кількість, площу клубочків, площу епітелію проксимальних і дистальних канальців.

Вимірювали об’єм діурезу, потім розраховували його з урахуванням маси тіла і на 1 год. У зразках сечі визначали кріоскопічним методом осмоляльність на осмометрі 3D3 (США). Концентрацію нітритів (NO₂) та нітратів (NO₃) плазми крові і сечі визначали фотометрично з використанням реактиву Грисса на спектрофотометрі СФ-46 (Росія) (l = 540 нм) [Ємченко Н. Л. і співавт., 1994]. Креатинін сечі та плазми крові досліджували фотометрично (l = 520 нм) за реакцією з пікриновою кислотою на спектрофотометрі СФ-46 (Росія) [Рябов С. І. і співавт., 1979]. Концентрацію білка сечі реєстрували фотометричним методом (l = 590 нм) у реакції із сульфосаліциловою кислотою на СФ-46 [Михєєва А. І., Богодарова І. А., 1969]. Концентрацію фосфатів у сечі та плазмі крові визначали фотометричним методом на СФ-46, попередньо провівши депротеїнізацію у присутності 5 % розчину трихлороцтової кислоти [Михєєва А. І., Богодарова І. А., 1969]. Концентрацію загального кальцію крові та сечі досліджували фотометричним методом (l = 590 нм) у реакції з Арсеназо-III на СФ-46, за допомогою стандартних наборів для in vitro діагностики («Simko ltd.», Україна). Розрахункові показники функціонального стану нирок на 100 г маси тіла тварин: екскрецію речовини із сечею, стандартизовані величини екскреції речовин, кліренс креатиніну, величини екскреції розраховуючи на 1 мл клубочкового фільтрату; обчислювали відповідно до методів, запропонованих Ю. В. Наточиним (1974) і О.Шюк (1981); Б. А. Пахмурним (1969); Е. Б.Берхіним, Ю. І. Івановим (1972).

Отримані дані обробляли математично програмою «Excel-7». Статистичний аналіз результатів проводили за загальноприйнятою методикою з використанням критерію Ст’юдента [Сергієнко В.І., Бондарева І.Б., 2006].

Результати дослідження. Порівняльний аналіз показників функції нирок щурів різних вікових груп при водному навантаженні вказує, що найбільший об’єм діурезу реєструється в молодшій віковій групі тварин (2,32±0,19 мл/год). Крім того, у групі тварин, які не досягли статевої зрілості, відзначаються найменша концентрація креатиніну у сечі 707±31 мкмоль/л, а також знижений показник його екскреції нирками. У щурів старшої вікової групи виявлено підвищений вміст креатиніну в плазмі крові 76±3 мкмоль/л порівняно з результатами двох інших груп (статевонезрілі і молоді статевозрілі). Описуючи залежні від віку зміни величини кліренсу креатиніну — найбільш інформативного маркера рівня швидкості клубочкової фільтрації — наголосімо, що за даними водного навантаження, величина цього параметра у групі статевонезрілих щурів і тварин старшої вікової групи вірогідно нижча, ніж у групі статевозрілих щурів.

При аналізі впливу навантаження 3 % розчином хлориду натрію на показники діяльності нирок у щурів досліджуваних вікових груп встановлено, що в даних умовах експерименту найбільш високий показник індукованого діурезу 2,71±0,19 мл/год відзначається у групі молодих статевозрілих щурів на фоні зниженої концентрації креатиніну в сечі (1123±65 мкмоль/л). Однак показник екскреції нирками креатиніну вірогідно вищий, ніж у групі тварин, що перебувають на стадії статевого дозрівання (3,04±0,14 і 1,97±0,15 мкмоль/год відповідно). У групі молодих статевозрілих щурів під впливом водно-сольового навантаження знижується вміст креатиніну в плазмі крові до 47±2 мкмоль/год — його значення вірогідно менше показника у старший віковій групі (71±2 мкмоль/год). На фоні зазначених вікових особливостей реакції нирок тварин на водно-сольове навантаження відзначимо максимальний приріст швидкості клубочкової фільтрації до 1079±62 мкл/хв у молодих статевозрілих тварин порівняно з показниками двох інших вікових груп (старший — 579±42 і статевонезрілих — 580±41 мл/год).

Розглянемо вікові особливості ниркового транспорту нітритів і нітратів у щурів в умовах водного навантаження. На наш погляд, важливо наголосити, що з віком вірогідно зростає вміст нітритів у сечі. Крім того, найбільш високий показник екскреції нітритів реєструється у старшій віковій групі ((4,62±0,31)x10^-3 мкмоль/год). Тим же часом темпи виділення нирками ендогенних нітритів у статевонезрілих і молодих статевозрілих тварин не мають виражених міжгрупових відмінностей. Стандартизація величин екскреції нітритів на одиницю об'єму клубочкового фільтрату (КФ) в основному підтверджує описану вище динаміку збільшення ниркових втрат нітритів із віком. Однак найнижчі рівні стандартизованої екскреції нітритів виявлені в групі молодих статевозрілих тварин ((0,76±0,05)x10^-4 мкмоль/1 мл КФ). Можливо, що в тому числі і ренальні механізми транспорту нітритів забезпечують більш високі значення концентрації нітритів у плазмі крові в молодих статевозрілих тварин. При цьому,даний механізм, швидше за все, не є основним фактором, оскільки у сечі статевозрілих щурів спостерігається високий вміст нітратів (10,73±0,76 мкмоль/л), що майже вдвічі перевищує аналогічний показник у групі статевонезрілих тварин (5,94±0,39 мкмоль/л). Подібні закономірності виявлені і при дослідженні плазми крові — концентрація  нітратів у статевозрілих щурів вірогідно вища, ніж у двох інших вікових групах. На основі одержаних результатів можна висунути припущення про те, що більш високі параметри концентрації нітритів — фізіологічно активних метаболітів молекули оксиду азоту — в плазмі крові молодих статевозрілих тварин зумовлені, з одного боку, порівняно низькими величинами їхнього ниркового кліренсу, а,з другого — процесами синтезу та секреції NO, що інтенсивно перебігають у молодому організмі.

Дійсно, непряме підтвердження висловлених припущень знаходимо у серії досліджень вікових особливостей нирок щурів на навантаження 3 % розчином хлориду натрію. Спостерігається закономірне підвищення концентрації нітритів у сечі з віком. Крім того, у тварин старшої вікової групи наявне виражене посилення екскреції нирками нітритів — майже у тричі порівняно з молодими статевозрілими тваринами і статевонезрілими щурами. Так само максимальних значень показник екскреції нітритів досягає у групі щурів старшої вікової групи. Значне підвищення концентрації нітратів у сечі відзначається у статевозрілих щурів, а показник екскреції нітратів у даній групі в кілька разів перевищує показники двох інших вікових груп. Екскреція нітратів, розрахована на одиницю клубочкового фільтрату, вірогідно вища у групі статевозрілих щурів.

Розглянемо результати дослідження вікових особливостей осморегулювальної функції нирок щурів в умовах водного навантаження. Встановлено, що величина осмоляльності сечі тварин з віком зменшується. При цьому, показник екскреції нирками осмотично активних речовин у статевозрілих щурів (129±9 мосмоль/кг Н₂О) вірогідно нижчий, ніж у статевонезрілих тварин (149±8 мосмоль/кг Н₂О), і вірогідно та значуще вищий, ніж у щурів старшої вікової групи (107±6 мосмоль/кг Н₂О). Разом із тим, темпи екскреції нирками осмотично активних речовин, розрахованих на 1 мл клубочкового фільтрату, у групі статевонезрілих щурів у три рази перевищує значення двох інших груп.

Слід наголосити, що дослідження вікових особливостей реакції нирок щурів на навантаження 3 % розчином хлориду натрію становить особливий інтерес, оскільки динаміка параметрів осморегулювальної функції нирок відбиває закономірні вікові зміни гомеостатичної ролі ренальних механізмів у виведенні з організму надлишкових кількостей осмотично активних речовин і води.

Отже, аналізуючи одержані результати, відзначимо, що істотне підвищення екскреції осмотично активних речовин спостерігається у групі молодих статевозрілих щурів (1,86±0,17 мосмоль/год), однак у статевонезрілих тварин показник екскреції, розрахованої на одиницю клубочкового фільтрату, підвищений до (39,94±3,17)x10^-3 мосмоль/1мл КФ). Ефективність ниркового кліренсу надлишкових кількостей осмотично активних речовин у молодих статевозрілих тварин є максимальною, тимчасом як у тварин старшої вікової групи спостерігається виразне зниження їх екскреції.

Аналіз вікових особливостей виділення інтактними нирками протеїнів в умовах водного навантаження демонструє, що в даних умовах у групі щурів, які перебувають на стадії статевого дозрівання, наявне зниження показників концентрації білка у сечі до 15±2 мг/л, екскреція білка (0,034±0,003 мг/год) також вірогідно нижча аналогічних параметрів у групах статевозрілих тварин (0,047±0,003 мг/год). Тим же часом, статистично значуще зростання екскреції білка, розрахованої на 1 мл клубочкового фільтрату, зареєстроване тільки у щурів старшої вікової групи ((1,73±0,11)x10^-3 мг/1 мл КФ). У ході дослідження вікової динаміки ниркових втрат протеїнів з кінцевою сечею в умовах навантаження сольовим розчином показано, що у щурів старшої вікової групи зростає концентрація білка у сечі до 47±4 мг/л. Тим же часом найбільш низьке значення екскреції білка в розрахунку на одиницю клубочкового фільтрату відзначається у групі статевозрілих тварин ((0,92±0,07)x10^-3 мг/1мл КФ). Такі спостереження свідчать про те, що найбільш виражений характер посилення ниркової екскреції білка, незалежно від виду навантаження, реєструється у тварин старшої вікової групи. З другого боку, абсолютні та стандартизовані значення екскреції білка в даній групі щурів не вказують на патологічний характер протеїнурії.

За даними водного навантаження встановлено, що у щурів із віком відбувається зниження концентрації кальцію у сечі, а також зменшення темпів виділення катіона із сечею. При цьому показник екскреції кальцію, стандартизований на 1 мл клубочкового фільтрату, у групі статевонезрілих щурів ((4,11±0,31)x10^-2 мкмоль/1мл КФ)у кілька разів перевищує аналогічні значення у групах статевозрілих тварин ((1,39±0,98)x10^-2 мкмоль/1мл КФ). При цьому у групі молодих статевозрілих щурів вміст фосфатів вірогідно нижчий, ніж у тварин, що перебувають на стадії статевого дозрівання. Екскреція фосфатів у групі статевонезрілих щурів (10,92±0,74 мкмоль/год) удвічі перевищує значення у двох інших вікових групах. Аналогічна динаміка зареєстрована для показника екскреції фосфатів у розрахунку на 1 мл клубочкового фільтрату. Під час вивчення вікових особливостей ниркового транспорту кальцію та фосфатів, за даними навантаження 3 % розчином хлориду натрію, встановлено вірогідне зниження концентрації кальцію у сечі щурів старшої вікової групи (1,76±0,12 мкмоль/л) порівняно з молодими (2,56±0,19 мкмоль/год) і статевонезрілими (2,96±0,21 мкмоль/год) тваринами. Крім того, найвище значення екскреції кальцію відзначається у статевозрілих щурів (7,01±0,52 мкмоль/год), однак у даній групі показник екскреції, розрахованої на одиницю клубочкового фільтрату, нижчий, ніж у статевонезрілих щурів, і вищий, ніж у тварин старшої вікової групи. У зазначеній групі також спостерігається найнижчий вміст фосфатів у сечі (7,86±0,54 ммоль/л), крім того, показник екскреції фосфатів, розрахованої на 1 мл клубочкового фільтрату, вірогідно нижчий, ніж у тварин двох інших вікових груп.

Таким чином, найбільш ефективні показники гомеостатичних функцій нирок зареєстровані у групі молодих статевозрілих тварин, що проявляється швидкою реакцією ренальних функцій у відповідь на надходження в організм значного об’єму  осмотично вільної води або надлишкових кількостей гіперосмотичного сольового розчину. Здійснення адекватних термінових реакцій нирок тварин даної групи у відповідь на введення навантажувальних проб можливе завдяки функціональній зрілості ниркової паренхіми та високій чутливості гуморальних систем авторегуляції. Структурно-функціональна незрілість ренальної паренхіми у групі статевонезрілих щурів є основною причиною встановлених особливостей реакції нирок тварин на 3 % розчин хлориду натрію. Зміни діяльності нирок у щурів старшої вікової групи зумовлені як скороченням популяції діючих нефронів, так і перебудовою внутрішньониркових систем гуморальної авторегуляції органа.