ПАТОГЕНЕЗ РЕНАЛЬНИХ ДИСФУНКЦІЙ ЗА УМОВ АЛОКСАНОВОГО ДІАБЕТУ У ЩУРІВ З РІЗНОЮ АКТИВНІСТЮ еNOS І ПРОТЕЇНКІНАЗИ С

Короткий зміст

Матеріал і методи дослідження. Дослідження виконане на 136 щурах самцях лінії Вістар масою тіла 220±15 г. Підготовка тварин до експериментів та інвазивні втручання здійснювалися з дотриманням відповідних вимог Європейської Конвенції до захисту хребетних тварин, які використовуються в дослідницьких та інших наукових цілях.

Розподіл тварин на групи проводили до моделювання цукрового діабету на основі оцінки стану систем внутрішньоклітинної сигналізації з урахуванням індивідуальних параметрів генетично детермінованої схильності до розвитку ендотеліальної дисфункції. З цією метою проводили оцінку базальної активності та резервної потужності ендотеліальної синтази оксиду азоту в тесті in vitro. В якості об’єкту вивчення активності ферменту використовували тромбоцити, що експресують східний з ендотелієм високий рівень eNOS. Для оцінки стану ланок внутрішньоклітинної сигнальної системи eNOS–Протеїнкіназа G та протеїнкіназ А і С використовували інгібіторний аналіз. Визначали амплітуду модулюючого впливу  трифтазину, L-аргініну, L-NAME, ОDQ (1H-[1,2,4]оксадіазоло[4,3-а]квіноксаліну-1, теофіліну, Н89 і стауроспорину на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів,  що дозволило інтерпретувати активність Са2+-кальмодуліну, eNOS, гуанілатциклази (ГЦ), фосфодіестераз, ПкА і ПкС відповідно. Агрегацію і дезагрегацію тромбоцитів реєстрували на спектрофотометрі СФ-46 шляхом виміру оптичної щільності світлового потоку, що проходить через суспензію клітин (Барінов Е.Ф. та інш., 2001). Базальна активність eNOS не розрізнялася статистично значуще у всіх тварин. Додавання L-аргініну в суспензію тромбоцитів, преінкубованих з АДФ, дозволяло скласти судження щодо резервної потужності ферменту. Даний ефект відрізнявся вираженою індивідуальною гетерогенністю. На підставі аналізу характеру розподілу параметрів АТ за умов інкубації з L-аргініном всіх тварин розділили на дві групи: з нормальною (індукована АТ знижувалася на 15-20%) і зниженою (індукована АТ змінювалася на 4-9%) резервною потужністю eNOS. Із групи тварин з нормальною резервною потужністю eNOS для моделювання ЦД відібрали 40 тварин, що сформували 1-у групу (нормореактивні щури), та 10 щурів використовували в якості контролю. Гіпореактивних тварин - щурів з низькою резервною експресією eNOS (n=76) - розділили на дві групи: 2-у – склали 40 гіпореактивних щурів з алоксановим діабетом без будь-якої фармакологічної корекції; інші 36 щурів віднесли до 3-ї групи, у якій використовували рубоксістаурин -  інгібітор протеїнкінази С. Препарат додавали в питну воду в дозі 32 мг/кг, яка відповідає IC50 – інгібуючій концентрації, що викликає 50% зниження активності ферменту (Idris I., 2006). Інгібітор ПкС призначали через 2 тижні після введення алоксану. В якості групи порівняння для щурів 2-3 групи використовували 10 інтактних гіпореактивних щурів.

Цукровий діабет моделювали через 16 годин після останнього годування тварин шляхом ін’єкції у хвостову вену алоксану з розрахунку 16 мг/кг маси тіла (Bagby S. P., 2007). Підтвердженням розвитку інсулярної недостатності вважали підвищення рівня глюкози в крові у межах 12-24 ммоль/л на 14-у добу експерименту. Масу тіла тварин, рівень глікемії й  глюкозурії вимірювали до початку експерименту, через 14 діб, 1, 2 й 3 місяці після введення алоксану. У ці ж терміни проводили аналіз стану систем внутрішньоклітинної сигналізації, а також структури й функції нирок.

Гістологічні зрізи нирок забарвлювали гематоксиліном та еозином, толуїдиновим синім, за методом Браше, ван Гізону, виконували PAS-реакцію (Саркисов Д.С., 1996). Оцінювали питомий обсяг (ПО) ниркових тілець (НТ), канальців нефронів і збірних трубок, перитубулярних капілярів, інфільтратів і сполучної тканини інтерстицію. Визначали діаметри НТ і судинного клубочка (СК), ширину сечового простору капсули Боумена, розраховували абсолютний обсяг НТ і СК (Matsumoto T., 1998). На підставі цього всі НТ ранжували на нормальні; гіпертрофовані, склерозовані (Dai T. R., 2006). В структурі СК оцінювали ПО гломерулярних капілярів і мезангіума, оцінювали щільність ядер клітин (кількість ядер на одиницю об’єму СК) і серед них подоцитів, ендотеліоцитів, мезангіальних клітин. Визначали ПО тубулярних профілів з нормальною будовою, гіпертрофією, ознаками клітинної й внутрішньоклітинної регенерації, дистрофічними змінами, проявами некрозу й апоптозу клітин (Evangelista C., 2006).

ШКФ розраховували за кліренсом креатиніну (Карпенко В. С., 1977). Концентрацію креатиніну в пробах крові і сечі визначали фотометрично на спектрофотометрі СФ-46 в реакції з пікриновою кислотою. Про канальцеву реабсорбцію судили за показниками екскреторної фракції натрію (EFNa) і води (EFН2О), кліренсу натрію (CNa). Концентрацію натрію в плазмі та сечі визначали методом полум’яної фотометрії. Проксимальну канальцеву реабсорбцію оцінювали за максимальною реабсорбцією глюкози (TGm) (Шюк О., 1981). Рівень глюкози в плазмі крові та сечі визначали глюкозооксидазним методом. Оцінку функціонування ТВЧПГ проводили на підставі аналізу кліренсу води, вільної від натрію (CNaН2O). Розраховували показники реабсорбції осмотично вільної води (TCH2O), кліренсу осмотично активних речовин (Cosm) і концентраційного індексу (Uosm/Posm). Осмолярність плазми крові та сечі оцінювали кріоскопічним методом на осмометрі “ОМКА-1Ц-01”. Всі показники  розраховували за загальноприйнятими формулами (Наточин Ю. В., 1974).

Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали на комп’ютері Pentium-III у середовищі Windows-ХР з використанням пакетів статистичних програм Statistica та MedStat (Лях Ю.Е., 2003) за допомогою варіаційного, кореляційного, регресійного, одно- і багатофакторного дисперсійного аналізу. Оцінювали характер розподілу ознаки, середнє арифметичне, стандартну помилку, середньо-квадратичне відхилення, коефіцієнти кореляції, критерії регресії, дисперсії, Стьюдента, Вілкоксона-Рао, Xi-квадрат і ступінь вірогідності статистичних показників (Гланс С., 1999). Вірогідність розходжень показників між експериментальними групами і контролем оцінювали за t-критерієм Стьюдента.

                Результати дослідження та їх обговорення. В інтактних щурів 1-ї групи ЕС50 АДФ становила 5,0±0,31 мкМ. Додавання в інкубаційну суміш ТФЗ супроводжувалося підвищенням АТ на 16,3±0,6% (р<0,05). Стимуляція й інгібування еNOS під дією L-аргініну  й L-NAME вели до зміни АТ відповідно  на 18,4±0,8% й 17,9±0,7% (р<0,05). Пригнічення активності ГЦ супроводжувалося підвищенням індукованої АТ на 18,3±0,9%, тоді як модулюючий ефект теофіліну досягав  13,2±0,4% (р<0,05). При введенні Н89 АДФ-індукована АТ збільшувалася на 8,2±0,23% (р<0,05), а стауроспорин знижував даний показник на 7,8±0,31% (р<0,05).

За умов експериментального ЦД у тварин 1-ї групи на 14 добу відзначалося підвищення активності системи eNOS–Протеїнкіназа G. Ефекти стимулятора й інгібітору eNOS у тесті in vitro були відповідно на 38,59% нижче й 40,22% вище, ніж в інтактних щурів (p<0,01). Активність ГЦ виявилася на 48,63% вище, ніж у контролі (p<0,01). Активація сигнальної системи eNOS-Протеїнкіназа G була обумовлена одночасною стимуляцією Са2+-кальмодуліна й протеїнкінази А. Про це свідчило посилення ефекту ТФЗ і Н89 відповідно на 24,53% й 42,68% (p<0,01) порівняно з показниками в інтактних щурів. Активність ФДЕ й ПкС, судячи з ефектів ТФ і стауроспорина, мало відрізнялися від контрольних значень. Через 1 місяць після введення алоксану в нормореактивних щурів зберігалася висока активність всіх ланок сигнального ланцюжка eNOS-ПкG. Ефект L-NAME був на 14,74% вище, ніж у попередній термін дослідження (p<0,05), і на 60,89% (р<0,01) перевищував контроль. Але при цьому фактично вичерпаною виявилася резервна потужність eNOS: додавання в інкубаційну суміш L-аргініну знижувало АТ лише на 8,1±0,2% (тобто в 2,27 рази нижче, ніж в інтактних щурів; p<0,001). Зіставлення ефектів ТФЗ й L-NAME свідчило про роль не тільки Са2+-кальмодуліну, але й незалежних від Са2+ механізмів регуляції eNOS. Відзначено підвищення активності ПкА на 28,2% у порівнянні з попереднім терміном дослідження (p<0,01), що на 82,93% перевищувало показник в інтактних щурів (p<0,001); приріст ефекту ТФЗ був менш значним - 11,33% (p<0,05). Ефект теофіліну на АТ зріс на 25,18% у порівнянні з попереднім терміном дослідження й на 31,82% перевищував такий в інтактних щурів (p<0,01). Ефект стауроспорина виявився на 12,19% більш виразним, ніж на 14-у добу, й на 17,94% перевищував показник у контролі (p<0,05). Через 2 місяці після введення алоксану відзначено зниження ефективності Са2+-залежної  стимуляції eNOS: ефект ТФЗ був на 19,01% нижчим за такий в інтактних щурів (p<0,05). Це супроводжувалося падінням активності eNOS - ефект L-NAME виявився на 29,61% (p<0,01) нижче контролю. Закономірно, що при цьому ефект Н89 став в 2,4 рази нижчим, ніж у попередній строк дослідження (p<0,001) і був на 24,39% меншим за показник в інтактних щурів (p<0,05). На відміну від цього, вплив стауроспорину на АТ зріс на 71,74% (p<0,01) у порівнянні з попереднім місяцем, й практично в 2 рази перевищував контрольні дані (p<0,001). Активність ГЦ знижувалася до показника в інтактних щурів. Але при цьому ефект теофіліну на АДФ-індуковану АТ виявився на 44,69% вищим, ніж у здорових тварин (p<0,01), прямо корелюючи з ефектами стауроспорину (r=0,840; p<0,01). Таким чином, через 2 місяці в нормореактивних щурів можна констатувати порушення  внутрішньо-клітинних механізмів адаптації до дії патогенетичних факторів ЦД.

Під час морфологічного дослідження нирок нормореактивних щурів через 14 діб після ін’єкції алоксана визначено гіперперфузію СК  переважно суперфіційної зони кіркової речовини. В них ПО капілярів зріс на 11,52% (p<0,05), простір капсули Боумена розширився на 6,36% (p<0,05). Це супроводжувалися підйомом ШКФ на 15,17% (p<0,05). Однак при цьому EFН2О и EFNa не відрізнялися статистично значуще від контролю, що свідчить про інтенсифікацію канальцевої реабсорбції. Гістологічний аналіз канальців нирки виявив розвиток гіпертрофії в 14,8±1,2% ПЗК. У багатьох клітинах тубулярного епітелію в кірковій речовині  мали місце ознаки активації ядра й синтетичних процесів у цитоплазмі. Це пояснювало підвищення ТGm на 63,63% (p<0,01) у порівнянні з контролем. Через 1 місяць ЦД розвивалася гіпертрофія нирок. Абсолютний обсяг НТ виріс на 29,58%, щодо такого у попередній термін дослідження (p<0,01) за рахунок збільшення ПО капілярів та мезангіальних клітин відповідно на 30,11% (p<0,01) і  18,79% у порівнянні з контролем (p<0,05). На цьому фоні приріст ШКФ склав 16,59% (p<0,05). На фоні стимуляції неоангіогенезу в кірковій речовині зареєстровано значну гіпертрофію ПЗК. Їх ПО зріс на 77,7% у порівнянні з попереднім терміном дослідження (p<0,001). Паралельно в деяких канальцях відзначено вакуолізацію цитоплазми, деструкцію щіточкової облямівки, перинуклеарний набряк і пікноз ядер епітеліоцитів. Але функціонально мало місце компенсаторне підвищення транспортних процесів в нефронах. Показник ТGm був в 2 рази вищим, ніж у інтактних щурів (p<0,001). Зростаюче об’ємне завантаження нефронів призвело до підсилення транспортних процесів у ТВЧПГ: CNaН2O зріс на 29,60% у порівнянні з попереднім терміном і на 35% перевищував контроль (p<0,01).                Протягом 2 місяця алоксанового діабету було відзначене підвищення ПО НТ із явищами гіпертрофії на 81,37% (p<0,01), а абсолютний обсяг НТ перевищив контрольний показник на 48,81% (p<0,01). Незважаючи на це ПО капілярів у СК знизився на 17,18% відносно показника в попередній місяць (p<0,05), але залишався на 7,76% вище контролю (p<0,05). Редукція гломерулярних капілярів була асоційована з експансією мезангіума, ПО якого виріс на 21,49% порівняно з попереднім терміном і на 44,29% - з контролем (p<0,01). Підвищення ШКФ на 17,15% протягом 2-го місяця (p<0,05) було асоційоване із порушенням цілісності фільтраційного бар’єра та розвитком протеїнурії. Зміни в гломерулі супроводжувалися зниженням транспортних процесів у канальцях нирок. Відзначене зростання EFН2О и EFNa відповідно на 21,71% й 30,17% порівняно з попереднім терміном дослідження (p<0,01). Морфологічно це було пов’язане з порушенням перитубулярної мікроциркуляції та цілісності ендотелію. В  периваскулярному інтерстиції на фоні набряку відзначене підвищення інфільтрації лейкоцитами та активація проліферації фібробластів. ПО сполучної тканини й інфільтратів виросли відповідно на 9,52% (p<0,05) і 99,5% у порівнянні з попереднім строком дослідження (p<0,001). Це призвело до підвищення ПО канальців з дистрофією й некрозом відповідно на 59,8% (p<0,01) і 87,5% (p<0,001). ПО канальців з явищами регенерації знизився на 17,24% (p<0,05), хоча, як і раніше, перевищував показник у контролі. Описані зміни прогресували до кінця 3-го місяця. Ключовими ознаками нефропатії у цей термін дослідження було підвищення ПО склерозованих НТ на 7,3% порівняно з попереднім місяцем (p<0,05) і ПО мезангіума на 73,05% (p<0,01), порівняно з контролем, що вело до посилення протеїнурії до 336,9±32,1 мг/добу. Зниження ПО гіпертрофованих канальців супроводжувалося підвищенням ПО канальців з дистрофічними й деструктивними змінами – відповідно на 30,6% й 41,3% (p<0,01). Результатом цього стало виразне підвищення діурезу на фоні стабілізації ШКФ. За 3-й місяць EFН2О и EFNa виросли відповідно на 19% й 24% (p<0,05), у результаті чого виявилися на 45,64% й 65,5% вище контролю (p<0,01). Одним з факторів підвищення екскреції було обмеження резервних можливостей ТВЧПГ - CNaН2O за минулий місяць знизився ще на 17% (p<0,05). Таким чином, у тварин 1-ї групи протягом 1-го місяця розвивається компенсаторна реакція, що пов’язана з активацією сигнальної системи eNOS-ПкG. Розвиток ренальних дисфункцій через 2 місяці діабету був асоційований зі зниженням активності eNOS, ГЦ і ПкА при активації ПкС і ФДЕ.

У гіпореактивних тварин відзначена активація сигнальної системи eNOS-ПкG через 14 діб експерименту. Однак вже через 1 місяць  зареєстроване зниження активності eNOS. Ефект L-NAME був на 40,28% й 24,09% (p<0,01) нижчим за такий у попередній термін дослідження й у інтактних щурів. При цьому активність ПкА була на 54,12% нижчою, ніж у попередній строк дослідження, на 43,18% меншою за вихідний рівень (p<0,01) і в 3 рази відрізнялася від показника в 1-й групі. Ефект стауроспорину навпаки виявився на 53,49% більшим, ніж у попередній строк дослідження й на 67,08% перевищив контрольний рівень (p<0,01). На фоні зниженої активності eNOS у щурів 2-ї групи підтримувався відносно високий рівень ГЦ (на 16,2% вище за показник в інтактних щурів; p<0,05). Активність ФДЕ виросла на 26,57% і перевищувала вихідний рівень на 38,16% (p<0,01), таким чином обмежуючи внутрішньоклітинний пул циклічних нуклеотидів й активацію ПкG. Протягом 2 місяця зниження активності всіх ланок сигнального ланцюжка еNOS-ПкG відбувалося на фоні прогресуючої гіперстимуляції ПкС і ФДЕ. Внаслідок цього наприкінці 3 місяця алоксанового діабету дефіцит базальної активності та резервної потужності eNOS склав відповідно  48,6% і 73,37% відносно показників у інтактних щурів (p<0,01). Активність ГЦ зменшилася на 14,88% відносно попереднього терміну дослідження й була на 21,86% нижчою за  контроль (p<0,05). Рівень активності ПкС і ФДЕ перевищив контрольні значення відповідно на 103,6% й 54,19% (p<0,001).

Морфологічним проявом цих патохімічних розладів був ранній розвиток гіпертрофії нирок. Через 14 діб визначено підвищення абсолютного обсягу НТ на 31,66% (p<0,01) у порівнянні з контролем і на 12% (p<0,05) відносно 1-ї групи. Приріст ШКФ був вищим, ніж в 1-й групі (18,82%; p<0,05). Відзначено більш виразне, ніж у нормореактивних тварин, підвищення проксимальної реабсорбції - ТGm була на 15,32% вищою за  показник в 1-й групі (p<0,05). І нарешті ‑ виявлена рання компенсаторна реакція ТВЧПГ – CNaН2O до 14 доби виріс на 19,26% у порівнянні з контролем (p<0,05). Через 1 місяць міжгрупові відмінності були більш значимими й виражалися в зміні балансу між компенсаторними й патологічними процесами в нирках. Відзначено набряк та інфільтрацію  ренального інтерстицію. ПО гіпертрофованих НТ виріс більш, ніж в 2 рази, у порівнянні з попереднім терміном дослідження, і на 58,82% перевищував показник в 1-й групі (p<0,01). Потовщення базальної мембрани гломерулярних капілярів супроводжувалося активацією мезангіуму, ПО якого був на 15,15% вищим, ніж у нормо реактивних  щурів (p<0,05). Зміни в канальцевому апарату проявлялися посиленням гіпертрофії і розвитком дистрофії в клітинах тубулярного епітелію. ПО канальців з дистрофічними змінами виріс більш, ніж в 2,5 рази у порівнянні з попереднім терміном й був на 80,43% вищим, ніж у щурів 1-ї групи (p<0,001). В цей термін зареєстровано значний приріст діурезу – 36,96% порівняно з попереднім терміном дослідження (p<0,01). Провідною причиною цього було зменшення канальцевої реабсорбції на фоні протеїнурії. Остання досягала 154,19±7,6 мг/добу, що було майже в 3 рази вище за показник у нормореактивних щурів в цей же термін дослідження. Екскреторна фракція води і натрію зросли відповідно на 15,4% й 22,8% (p<0,05), і на 9,98% і 14,46% перевищували показники в 1-й групі (p<0,05). Наслідком цих змін було зростання  СNa на 45,4% відносно контролю (p<0,01).

Через 2 місяці в НТ зафіксовано зниження ПО гломерулярних судин (на 21,86% у порівнянні з попереднім строком дослідження; p<0,05;  і на 21,18% відносно 1-ї групи; p<0,05) та збільшенням ПО мезангіуму (який був на 7,09% вищим, ніж в 1-й групі; p<0,05;  і на 65,96% перевищував контроль; p<0,01). Зареєстроване чергування зон альтерації  та ремоделю-вання кіркової речовини діабетичних нирок, що супроводжувалося зростанням ПО інфільтратів практично в 2 рази порівняно з попереднім терміном дослідження і на 69,59% до показника у нормореактивних щурів. На цьому фоні зареєстровано стабілізацію ШКФ за умов протеїнурії та зниження канальцевої реабсорбції. Максимальної виразності функціональні розлади в нирках гіпореактивних щурів були зафіксовані до кінця 3 міс. В цей термін зареєстроване зниження ШКФ на 12% порівняно з попереднім терміном і на 17,1% відносно 1-ї групи на фоні прогресування протеїнурії, рівень якої практично в 1,54 рази був вище показника у нормореактивних щурів. Крім того, протягом 3 міс відзначено розвиток фіброзу, асоційованого зі  зниженням проксимальної й дистальної канальцевої реабсорбції та обмеженням механізмів осморегуляції. Тобто у гіпореактивних щурів гіперстимуляція ПкС через 1 міс веде до розвитку діабетичної нефропатії за рахунок зниження активності сигнальної системи eNOS-ПкG, порушення структурно-функціонального стану нирок внаслідок мікроциркуляторних розладів, мезангіальної експансії і протеїнурії, розвитку запальної реакції та тубуло-інтерстиційного ушкодження, що прогресували до кінця 3 місяця експерименту.

В 3-й групі за умов інгібування ПкС відзначено пролонгування адаптаційного підйому активності eNOS і ГЦ до кінця 1 міс. Ефект L-NAME й інгібітору ГЦ був на 76,19% й 62,56% (p<0,01) вищим, ніж у 2-й групі.  Це було пов’язане з посиленням Са2+-кальмодулін і ПкА залежної модуляції активності сигнальної системи eNOS-ПкG. Вплив ТФЗ був на 55,93% (p<0,01) вищим, ніж у 2-й групі. Модулюючий ефект Н89 виявився на 24,77% вищим, ніж у попередній строк дослідження (p<0,01), і перевищував значення показника у контролі та у 2-й групі відповідно на 54,55% й в 2,7 рази (p<0,001). Через 2 місяці алоксанового діабету інгібітор ПкС обмежував пригнічення сигнальної системи eNOS-ПкG. Ефект ТФЗ  виявився на 32,61% вищим за показник у тварин 2-ї групи (p<0,01). Незважаючи на зниження активності eNOS на 39,64%, остання була на 38,14% (p<0,01) вищою, ніж у 2-й групі. Активність ПкА залишалася на 12,5% більшою, ніж в інтактних тварин (p<0,05), і в 2,35 рази перевищувала показник у щурів 2-ї групи (p<0,001). Активність ГЦ за 2-й міс зменшилась на 35,74% (p<0,01), але перевищувала аналогічний показник у 2-й групі на 11,31% (p<0,05). На відміну від цього ефект теофіліну виріс незначно – на 5,96% (p>0,05) — і був на 19,19 % нижчим, ніж в 2-й групі (p<0,05). Через 3 місяці у щурів 3-ї групи, на відміну від тварин 1-ї й 2-ї груп, зниження ефектів ТФЗ й L-NAME носило недостовірний характер. Ці показники були на 22,36% й 22,89% нижчими, ніж у контролі (p<0,05), але перевищували показники у 2-й групі відповідно на 34,09% й 39,13% (p<0,01). Ефект Н89 знизився на 29,29% (p<0,01) і став на 20,45% нижчим за контроль (p<0,05), проте, був на 84,4% вищим за показник у тварин 2-ї групи (p<0,001). Виявлено зниження активності ГЦ на 17,61% у порівнянні з  попереднім строком дослідження (p<0,05), але даний показник був на 11,18% й 7,43% вищим, ніж у 2-й й 1-й групах відповідно (p<0,05). При цьому активність ФДЕ була на 11,38 й 10,05% нижчою, ніж відповідно у 2-й та 1-й групах (p<0,05). Цей факт із урахуванням зареєстрованої активності ГЦ свідчить про більш високий внутрішньоклітинний рівень цГМФ, що може стримувати приріст внутрішньоклітинного Са2+ й явища оксидативного стресу. Таким чином, інгібування ПкС запобігає розвитку ендотеліальної дисфункції. Морфологічно це проявлялося зміною програми ремоделювання НТ. Розміри НТ через 1 місяць були на 11,3% нижчими, ніж у 2-й групі, що було пов’язане із обмеженням активації мезангіальних клітин. Через 2 місяці після моделювання експериментального діабету об’єм НТ був на 36% вищим, ніж у гіпореактивних щурів без корекції. Цей ефект був пов’язаний з підтриманням високого ПО гломерулярних капілярів при низьких значеннях ПО мезангіуму. Ці дані відбивають роль ПкС у розвитку мезангіальної експансії й гломерулосклерозу за умов ЦД. Крім того, відзначене зниження ПО інфільтратів на 38,2% та ПО канальців з дистрофічними явищами (на 30%; p<0,05). Аналіз функціонального стану нирок у щурів 3-ї групи показав, що інгібування ПкС через 1 міс експерименту веде до зниження діуретичної реакції за рахунок обмеження ступеня гіперфільтрації й підтримання оптимальної канальцевої реабсорбції. Позитивний ефект на фільтрацію проявлявся також зниженням ступеня протеїнурії. Концентрація білка в сечі щурів 3-ї групи через 1 місяць експерименту була на 85,5%, а через 2 місяці – в 2,1 рази нижчою за  таку у гіпореактивних щурів без корекції. При цьому розходження з показниками у нормореактивних щурів  носили недостовірний характер. Аналіз транспортних процесів виявив підтримання високої проксимальної реабсорбції протягом 3 місяців й тривалий компенсаторний підйом гіпоосмотичної реабсорбції у ТВЧПГ.

Таким чином, інгібування ПкС у гіпореактивних щурів за умов ЦД оптимізує роботу внутрішньоклітинних сигнальних систем, знижує виразність мікроциркуляторних порушень, гломерулосклерозу та запальної інфільтрації строми, гіпертрофії і дистрофії канальців, що обмежує ренальні дисфункції. Отримані результати свідчать про роль гіперстимуляції ПкС у розвитку ендотеліальної дисфункції та порушенні структурно-функціонального стану нирок за умов дії патогенетичних факторів ЦД. Ці факти можуть бути використаними для прогнозування розвитку ДН і розробки методів фармакологічної корекції й профілактики ренальних дисфункцій за умов ЦД.

ВИСНОВКИ

                У дисертаційній роботі проведене теоретичне узагальнення й нове рішення актуальної та мало вивченої наукової задачі, що полягає в з’ясуванні ролі сигнальної системи eNOS-протеїнкіназа G і протеїнкінази С у патогенезі ренальних дисфункцій за умов цукрового діабету залежно від індивідуальних особливостей експресії eNOS.

1. На суспензії тромбоцитів у інтактних тварин зареєстровані індивідуальні особливості резервної  потужності еNOS (в 1-й групі – 15-20% – нормореактивні щури; в 2-й групі – 4-9% – гіпореактивні тварини), що визначає реактивність організму на дію патогенетичних факторів ЦД.

2. У нормореактивних щурів протягом 1 місяця після моделювання алоксанового діабету стимуляція сигнальної системи eNOS-ПкG забезпечується Са2+-кальмодулін- і ПкА-залежними механізмами; при цьому формується гіпертрофія нирок, зростає ШКФ (на 35%; p<0,01) і реабсорбція глюкози (на 103%; p<0,001). Через 3 міс пригнічення системи eNOS-ПкG на фоні активації ПкС і ФДЕ супроводжувалося мезангіальною експансією, альтерацією канальців та інфільтрацією строми, розвитком протеїнурії (336,96±32,1 мг/добу) і підвищенням EFH2O й EFNa  на 45,6% і 65,5% відносно контролю (p<0,01).

3. У гіпореактивних щурів  через 14 діб  виявлена компенсаторна активація eNOS і через 1 міс – зниження її активності (на 24,09% порівняно з контролем; p<0,01) внаслідок обмеження ПкА-залежного механізму та стимуляції ПкС. Прогресуюче пригнічення сигнальної системи eNOS-ПкG і ПкА  до кінця 3 місяця було пов’язане з гіперактивністю ПкС і ФДЕ (на 103,6% і 54,19% більше, ніж у інтактних щурів; p<0,001).

4. У гіпореактивних тварин відзначено ранню (на 14 добу) гіпертрофію ниркових тілець і проксимальних канальців. Через 1 місяць мали місце проліферація мезангіальних клітин і розвиток протеїнурії (в 2,83 рази вище, ніж у нормореактивних щурів; p<0,001), інфільтрація строми та дистрофія тубулярного епітелію. Через 3 місяця відзначене зменшення ШКФ, зниження реабсорбції у ТВЧПГ і осмоконцентрування (СNaН2O – на 29,17%; ТСН2О/V – на 9,82% менше контрольних значень; р<0,05).

5.  Інгібування ПкС у гіпореактивних щурів за умов алоксанового діабету запобігало ранньому порушенню функціонування внутрішньоклітинного сигнального шляху eNOS-ПкG. Цей ефект був пов’язаний з підтриманням активності ПкА і ГЦ, які наприкінці 3 місяця перевищували аналогічні значення у 2-й групі (відповідно на 84,4%  і 11,18%; p<0,05), та запобіганням стимуляції ФДЕ (активність була на 11,38% нижчою за таку у 2-й групі; p<0,05).

6. Використання інгібітору ПкС у ранній термін діабету (через 1 міс) обмежувало протеїнурію (на 85,5%; p<0,001); гіпертрофію нирок і приріст реабсорбції глюкози у ПЗК. Через 2 міс відзначене зниження інфільтрації строми нирки (на 38,2% порівняно з 2-ю групою; p<0,01) і альтерації канальців (на 30% нижче, ніж в 2-й групі; p<0,01). Через 3 міс ефект інгібітору ПкС проявлявся зниженням гломерулосклерозу, протеїнурії (в 2,1 рази; p<0,001) і тубуло-інтерстиційного ушкодження.