Воєйкова Дарина Олександрівна Структурно-функціональний стан внутрішньої мітохондріальної мембрани гепатоцитів щурів за умов розвитку стеатогепатозу

Короткий опис

Воєйкова Дарина Олександрівна, науковий співробітник лабораторії імунохімії ТОВ «Науково-виробниче об’єднання «Біовелл»: «Структурно-функціональний стан внутрішньої мітохондріальної мембрани гепатоцитів щурів за умов розвитку стеатогепатозу» (03.00.04 - біохімія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевчен­ка

Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
На правах рукопису
ВОЄЙКОВА ДАРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА
УДК 576.34:577.126:612.35 (043)
СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ВНУТРІШНЬОЇ
МІТОХОНДРІАЛЬНОЇ МЕМБРАНИ ГЕПАТОЦИТІВ ЩУРІВ ЗА УМОВ
РОЗВИТКУ СТЕАТОГЕПАТОЗУ
03.00.04 — біохімія
Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник
Остапченко Людмила Іванівна,
доктор біологічних наук,
професор
Київ – 2017
2
ЗМІСТ
Перелік умовних скорочень…………………………………………... 6
Вступ……………………………………………………………………… 8
Розділ 1. Огляд літератури…………………………………………….. 14
1.1 Механізми розвитку неалкогольної жирової хвороби печінки 14
1.2 Методи моделювання стеатогепатозу в експериментальних
тварин……………..…………………………………………….. 17
1.3 Роль розвитку «мітохондріальної дисфункції» в патогенезі
стеатогепатозу………….……………………………………… 22
1.4 Механізм впливу тіазолідіндіонів на патогенез
неалкогольноїжирової хвороби печінки………………..…….. 26
Розділ 2. Матеріали та методи експериментальних досліджень… 29
2.1 Використані матеріали та реактиви…………………………… 29
2.2 Умoви прoведення експерименту……………………………... 29
2.3 Методи отримання експериментального матеріалу.………… 31
2.3.1 Виділення загальної фракції гепатоцитів щурів……… 31
2.3.2 Отримання сироватки крові щурів…………....……….. 32
2.3.3 Виділення мітохондрій та субмітохондріальних
частинок гепатоцитів………….…………………..…… 32
2.3.4 Визначення концентрації білка за методом Лоурі….… 33
2.4 Методи визначення ліпідного складу мітохондріальної
мембрани………………………………………………………... 34
2.4.1 Екстракція ліпідів…………………..…………………… 34
2.4.2 Визначення вмісту загальних ліпідів внутрішньої
мембрани мітохондрій………………………………..... 34
2.4.3 Розділення фосфоліпідів методом тонкошарової
хроматографії…………………………………………... 35
3
2.4.4 Визначення вмісту вільного та етерифікованого
холестеролу…………………………………………….. 36
2.5 Вимірювання ферментативної активності у внутрішній
мембрані мітохондрій………………………………………….. 37
2.5.1 Визначення НАД∙Н-КоQ-оксидоредуктазної
активності внутрішньої мембрани мітохондрій…….. 37
2.5.2 Дослідження сукцинат-КоQ-оксидоредуктазної
активності внутрішньої мембрани мітохондрій…….. 37
2.5.3 Визначення КоQ-цитохром с-оксидоредуктазної
активності внутрішньої мембрани мітохондрій…….. 39
2.5.4 Визначення цитохромоксидазної активності
внутрішньої мембрани мітохондрій…………………. 40
2.5.5 Н+
- АТФазна активність внутрішньої мембрани
мітохондрій……………………………………………. 40
2.6 Електрофорез у поліакриламідному гелі за присутності
додецилсульфату натрію……………………………………... 41
2.7 Визначення загального і прямого білірубіну у сироватці
крові за методом Ендрашика………………………………… 41
2.8 Визначення вмісту сечовини у сироватці крові
діацетилмонооксимним методом……………………………. 41
2.9 Визначення активності аспартатамінотрансферази
динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля…. 42
2.10 Визначення аланінатамінотрансферазної активності
динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля…. 43
2.11 Визначення лужнофосфатазної активності у сироватці
крові за кінетичним методом з ДЕА-буфером………………. 44
2.12 Визначення гамма-глутамілтранспептидазної активності в
сироватці крові………………………………………………... 45
4
2.13 Визначення вмісту альбуміну у сироватці крові щурів за
методом з бромкрезоловим зеленим………………………… 46
2.14 Визначення глюкози у сироватці крові щурів
глюкооксидазним методом…………………………………… 47
2.15 Визначення тимолової проби у сироватці крові щурів……... 48
2.16 Статистична обробка даних………………………………….. 48
Розділ 3. Характеристика стану гепатоцитів щурів за умов дієтіндукованого стеатогепатозу………………………………………….. 49
3.1 Антропометричні дані експериментальних тварин з дієтіндукованим стеатогепатозом…………..……………………... 50
3.2 Ліпідний склад внутрішньої мітохондріальної мембрани
гепатоцитів за умов моделювання дієт-індукованого
стеатогепатозу………………………………………………….. 54
3.3 Фосфоліпідний склад внутрішньої мітохондріальної
мембрани гепатоцитів щурів…………………………………... 60
3.4 Ферментативна активність комплексів електронтранспортного ланцюга внутрішньої мітохондріальної
мембрани за умов моделювання розвитку дієт-індукованого
стеатогепатозу………………………………………………….. 65
3.5 Відносний вміст білків гепатоцитів за умов дієтіндукованого стеатогепатозу…………………………………... 67
3.6 Біохімічні показники сироватки крові щурів з дієтіндукованим стеатогепатозом…………………………………. 70
Розділ 4. Структурно-функціональний стан гепатоцитів щурів за
умов глутамат-індукованого стеатогепатозу та його корекції…… 77
4.1 Антропометричні дані експериментальних тварин з
глутамат-індукованим стеатогепатозом та за умов корекції
піоглітазоном…………………………………………………… 78
5
4.2 Ліпідний склад внутрішньої мітохондріальної мембрани
гепатоцитів за умов глутамат-індукованого стеатогепатозу
та його корекції………………………………………………… 81
4.3 Фосфоліпідний склад внутрішньої мітохондріальної
мембрани гепатоцитів за умов глутамат-індукованого
стеатогепатозу та його корекції……………………………... 85
4.4 Ферментативна активність комплексів електронтранспортного ланцюга внутрішньої мітохондріальної
мембрани за умов розвитку глутамат-індукованого
стеатогепатозу та його корекції……………………………….. 89
4.5 Відносний вміст білків гепатоцитів за умов глутаматіндукованого стеатогепатозу та його корекції ……………….. 93
4.6 Біохімічні показники сироватки крові щурів з глутаматіндукованим стеатогепатозом та з його корекцією…………... 95
Узагальнення…………………………………………………………… 102
Висновки………………………………………………………………… 110
Список використаних джерел………………………………………… 112
6
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АлАТ – амінотрансферази
АсАТ – аспартатамінотрансферази
АФК — активні форми кисню
ВКД – висококалорійна дієта
ВООЗ – Всесвітньої організації охорони здоров’я
ГГТ — γ-глутамілтранспептидаза
ГН – L-глутамат натрію
ДНК — дезoксирибoнуклеїнoва кислoта
ДНФ – динітрофенол
ДСН – дoдецилсульфат натрію
ЕГТА – етиленгліколі-біс-(β-аміноетил етер)-N’N’N’N’-тетраацетатна
кислота
ЕДТА — етилендіамінтетраетилацетат
ЕПР — ендоплазматичний ретикулум
ЕТЛ – електрон-транспортний ланцюг або дихальний ланцюг
ІЛ — інтерлейкін
ІМТ – індекс маси тіла
КЛ – кардіоліпін
ЛПДНЩ – ліпопротеїни дуже низької щільності
ЛПВЩ – ліпопротеїни високої щільності
ЛПНЩ – ліпопротеїни низької щільності
ЛФЕА – лізофосфатидилетаноламін
ЛФХ – лізофосфатидилхолін
м.м. – молекулярна маса
НАД+ — нікотинамідаденіндинуклеотид окиснений
НАД+ — нікотинамідаденіндинуклеотид окиснений
НАДН – нікoтинамідаденіндинуклеoтид віднoвлений
НЖХП – неалкогольна жирова хвороба печінки або стеатогепатоз
7
ПВК – піровиноградна кислота
ПНЖК – поліненасичених жирних кислот
ПОЛ — перекисне окиснення ліпідів
ПОМК – проопіомеланокортин
СДГ – сукцинат-КоQ-оксидоредуктаза
СМЧ – субмітохондріальні частинки
СОД - сукцинатоксидоредуктаза
ТХО – трихлороцтова кислота
ФАД – флавінаденіндинуклеотид
ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид
ФЕА –фосфатидилетаноламін
ФІ – фосфатидилінозитол
ФНП-α — фактор некрозу пухлин α
ФП – флавопротеїн
ФС – фосфатидилсерин
ФХ – фосфатидилхолін
ЦТК – цикл трикарбонових кислот
PPR-γ – peroxisome proliferator-activated receptor gamma
H2SO4 – сірчана кислота
TGF-β – трансформуючий фактор росту β
8
ВСТУП
Актуальність теми. В умовах сучасного суспільства, коли значно
розповсюджене надмірне споживання вуглеводів і жирів поряд з низькою
фізичною активністю, проблеми порушення основного обміну набувають
надзвичайного поширення. За даними Всесвітньої організації охорони
здоров’я (ВООЗ), лише в Європі кількість людей, які страждають на
метаболічні порушення, надлишкову вагу і супутні ускладнення, знаходиться
в межах від 40 до 60 мільйонів, і з віком частота виникнення та розвитку цих
патологічних станів все більше зростає. Серед ускладнень метаболічних
порушень особливу увагу привертає стеатогепатоз або неалкогольна жирова
хвороба печінки (НЖХП), яку на сьогоднішній день вважають однією з
найбільш поширених форм прояву порушень основного обміну [49, 50, 128].
Аналіз літератури свідчить, що механізми розвитку НЖХП досі
досконально не вивчені, що може бути пов’язано з широким колом факторів,
які викликають це захворювання [47, 66, 70]. Висунуто лише гіпотезу про
двоетапність розвитку НЖХП, за якою значне підвищення рівня
циркулюючих триацилгліцеролів на її ранньому етапі є фактором запуску
розвитку стеатогепатозу [49, 50]. Результатом накопичення ліпідів у
гепатоцитах стає балонна дистрофія, некроз, фіброзні явища в печінці, а у
деяких випадках і розвиток гепатокарциноми [55, 56, 60]. На другому етапі
стеатогепатозу розвивається запальний процес у відповідь на некротичні і
апоптичні явища; його механізм досить добре описаний [23, 24, 36]. Також
відомо, що НЖХП супроводжується розвитком «мітохондріальної
дисфункції», однією з ознак якої є окисний стрес, порушення функціональної
активності комплексів електрон-транспортного ланцюга (ЕТЛ або дихальний
ланцюг), пошкодження ДНК та зміни ліпідного складу мембрани
мітохондрій. Проте, залишається не з’ясованим, на якому етапі НЖХП
розвивається окисний стрес, і чи є він причиною, чи наслідком розвитку цієї
патології.
9
Функціональну активність комплексів ЕТЛ у щурів із
стеатогепатозом, викликаним різними висококалорійними дієтами (ВКД),
досліджено в ряді робіт [71, 81, 105, 109]. В них показано, що у
експериментальних тварин, які перебували на дієтах різного складу та
терміну утримання, виявлено або повне, або часткове падіння
функціональної активності дихального ланцюга поряд зі значними змінами в
ліпідному складі власне мітохондріальної мембрани. Проте, найменш
дослідженим і описаним є структурно-функціональний стан мітоходрій
гепатоцитів у тварин, яких утримували на дієті з високим вмістом жирів і
вуглеводів (#C11024, Research Dietes, New Brunswick, NJ), що є найбільш
наближеною до можливого характеру харчування людей з надмірною вагою.
Що стосується глутамат-індукованого стеатогепатозу, на сьогодні відомі лише
2 роботи, які містять суперечливу інформацію щодо активності комплексів
ЕТЛ і не показують даних про ліпідний склад внутрішньомітохондріальної
мембрани [95, 133].
Тому актуальним є дослідження активності комплексів ЕТЛ у щурів зі
стеатогепатозом, який викликаний як ВКД #C11024 з високим вмістом жирів
і вуглеводів, так і неонатальним введенням L-глутамату натрію (ГН). Аналіз
одержаних результатів дозволить виявити як спільні механізми розвитку
стеатогепатозу, так і удосконалити сучасні методи його лікування.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тематика
досліджень дисертаційної роботи пов’язана з науковими програмами
Київського національного університету імені Тараса Шевченка і
виконувалася на базі кафедри біохімії в рамках наукової теми «Механізми
реалізації адаптаційно-компенсаторних реакцій за умов розвитку різної
патології» № д/р 0111U009878. Здобувач брав участь у виконанні цих робіт
як виконавець.
Мета і задачі дослідження. Метою досліджень було оцінити
структурно-функціональний стан мітохондрій гепатоцитів щурів за умов
розвитку стеатогепатозу різної етіології.
10
Для досягнення мети роботи були поставлені наступні задачі:
1. Проаналізувати особливості зміни маси тіла тварин з дієт- і
глутамат-індукованим стеатогепатозом та при введенні піоглітазону.
2. Визначити загальний вміст ліпідів, фосфоліпідів, холестеролу та
його ефірів у внутрішній мітохондріальній мембрані гепатоцитів щурів за
умов дієт- і глутамат-індукованого стеатогепатозу та при введенні
піоглітазону.
3. Визначити ферментативну активність мітохондріальних
комплексів ЕТЛ гепатоцитів щурів за умов дієт- і глутамат-індукованого
стеатогепатозу та при введенні піоглітазону.
4. Визначити вміст та розподіл білків у печінці щурів за умов дієт- і
глутамат-індукованого стеатогепатозу та при введенні піоглітазону.
5. Визначити біохімічні параметри сироватки крові щурів за умов
дієт- і глутамат-індукованого стеатогепатозу та при введенні піоглітазону.
Об’єкт дослідження: структурно-функціональний стан мітохондрій
гепатоцитів за умов розвитку стеатогепатозу різної етіології та при введенні
піоглітазону.
Предмет дослідження: ліпідний склад внутрішньої мітохондріальної
мембрани, активність комплексів ЕТЛ, вміст білків у гепатоцитах та
біохімічні параметри сироватки крові щурів за умов стеатогепатозу та при
введенні піоглітазону.
Методи дослідження: ультрацентрифугування (виділення фракції
внутрішньої мітохондріальної мембрани), спектрофотометричні (визначення
загального вмісту ліпідів, фосфоліпідів, холестеролу та його ефірів,
ферментативної активності комплексів ЕТЛ, біохімічних маркерів стану
печінки), хроматографічні (визначення фосфоліпідного складу внутрішньої
мітохондріальної мембрани), електрофоретичні (визначення вмісту білків у
гепатоцитах) та методи математичної статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено аналіз
структурно-функціонального стану мітохондрій та гепатоцитів в цілому за
11
умов розвитку стеатогепатозу, спричиненого двома різними етіологічними
факторами. Встановлено, що за умов глутамат-індукованого стеатогепатозу у
тварин виникає ожиріння вищого ступеня в порівнянні з тваринами, яких
утримували на дієті, збагаченій жирами і вуглеводами. Вперше встановлено,
що за умов глутамат-індукованого стеатогепатозу спостерігається значне
підвищення вмісту окиснених форм фосфоліпідів у мембрані мітохондрій,
ніж у тварин з дієт-індукованим стеатогепатозом, що вказує на розвиток
окисного стресу різного ступеня тяжкості в обох випадках. Визначено, що
споживання значної кількості жирів і вуглеводів змінює функціонування
комплексів ЕТЛ, але не призводить до зниження їх активності, як у випадку
неонатального введення ГН. Показано, що змодельований різними шляхами
стеатогепатоз супроводжується однаковими змінами діагностичних маркерів
стану печінки щурів. Вперше продемонстровано здатність піоглітазону
знижувати ступінь розвитку окисного стресу у мітохондріях та частково
відновлювати активність комплексів ЕТЛ до контрольних значень за умов
розвитку глутамат-індукованого стеатогепатозу.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані
дозволяють розширити та доповнити сучасні уявлення про роль
«мітохондріальної дисфункції» у розвитку стеатогепатозу як одного з
ключових явищ у патогенезі цього захворювання. Доведено, що значні дози
ГН викликають більш істотні патологічні зміни у печінці порівняно зі
змінами за умов утримання тварин на ВКД. Доведено, що патогенез
стеатогепатозу різної етіології включає розвиток «мітохондріальної
дисфункції» та має ознаки окисного стресу. Отримані у дисертаційній роботі
дані впроваджено у навчальний процес курсів лекцій «Біохімічна
фармакологія», «Фізіологія травлення та харчування».
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проаналізовано
наукову літературу за темою роботи, виконано експериментальні
дослідження та здійснено підготовку матеріалів до публікації. Здобувачем
підготовлено доповіді, які включали результати досліджень, написано та
12
подано до друку статті та тези в матеріалах конференцій та з’їздів. За участю
співавторів публікацій проведено інтерпретацію отриманих результатів.
Планування експерименту та розробка методичних підходів, формування
ідей роботи, узагальнення результатів досліджень та редагування
дисертаційної роботи здійснено спільно з науковим керівником.
Апрoбація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної
роботи доповідалися та обговорювалися на: IV Міждисциплінарній
конференції «Биологические активные вещества и материалы:
фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новий
Світ, 2013), ХІ міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів
"Молодь і поступ біології" (Львів, 2015), ХІІІ міжнародній науковій
конференції молодих науковців "Шевченківська весна: біологія" (Київ, 2015),
Науково-практичній конференції "Мультипробіотики в лікуванні і
профілактиці найбільш поширених захворювань" (Київ, 2015), X
Міжнародній науковій конференції молодих науковців «Біологія: від
молекули до біосфери» (Харків, 2015), VІІ Всеукраїнській науковопрактичній конференції «Біологічні дослідження – 2016» (Житомир, 2016),
XII Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і
поступ у біології» - (Львів, 2016).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць, у
тому числі 6 статей у фахових вітчизняних та міжнародних періодичних
виданнях, з яких 1 публікація у виданні, включеному до міжнародних
наукометричних баз, 1 стаття у нефаховому виданні та 8 тез у матеріалах
з’їздів та конференціяй.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу,
огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх
обговорення, висновків та списку використаних літературних джерел, що
включає 176 найменувань. Робота викладена на 132 сторінках друкованого
тексту, ілюстрована 11 таблицями і 7 рисунками.
Висновок біоетичної експертизи. Роботу виконано на білих нелійних
13
щурах, які утримувалися в умовах стандартного раціону віварію. Впродовж
усього експерименту тварини не зазнавали жорстокого поводження і
негуманного умертвіння. Дослідження відповідають основним вимогам
утримання та роботи з лабораторними тваринами відповідно до правил
Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, які
використовуються в експериментальних дослідженнях та інших наукових
цілях (Страсбург, 1986 р.), та згідно з етичними нормами у відповідності до
українського законодавства.
Автор висловлює щиру подяку своєму науковому керівникові доктору
біологічних наук, професору Остапченко Людмилі Іванівні за постановку
розглянутих у дисертаційній роботі задач, цінні рекомендації, технічний
супровід та увагу до роботи, старшому науковому співробітнику
Степановій Людмилі Іванівні за допомогу у проведенні експериментальних
досліджень та увагу до роботи, доктору біологічних наук, професору
Береговій Тетяні Володимирівні за дoпoмoгу у підбoрі метoдичних підхoдів,
прoведенні експериментальних дoсліджень та увагу дo рoбoти.

Список літератури

ВИСНOВКИ
1. Встановлено значні зміни структурно-функціонального стану
мітохондрій гепатоцитів за умов дієт- і глутамат-індукованого
стеатогепатозу, що призводить до «мітохондріальної дисфункції» за розвитку
обох досліджуваних патологій.
2. Встановлено значне зростання маси вісцеральної адипозної
тканини за обох моделей стеатогепатозу. У тварин з глутамат-індукованим
стеатогепатозом збільшення маси адипозної тканини було більш вираженим
(у 46 разів, р<0,001) у порівнянні з тваринами з дієт-індукованим
стеатогепатозом (у 2 рази, р<0,01).
3. Показано, що розвиток стеатогепатозу, незалежно від етіології,
супроводжується зростанням загального вмісту ліпідів і фосфоліпідів у
внутрішній мітохондріальній мембрані та значним підвищенням вмісту
холестеролу (у 2,4 рази (р<0,05) за умов дієт-індукованого стеатогепатозу та
у 3,5 рази (р<0,001) за умов глутамат-індукованого стеатогепатозу).
4. Встановлено, що як дієт-, так і глутамат-індукований
стеатогепатоз обумовлює значне підвищення вмісту окиснених форм
основних фосфоліпідів. За умов утримання тварин на ВКД вміст
лізофофатидилхоліну і лізофосфатидилетаноламіну зростав, відповідно, у 1,7
(р<0,01) і 1,4 (р<0,01) рази, а за умов глутамат-індукованого стеатогепатозу –
у 9,2 (р<0,001) і 5,5 (р<0,001) рази.
5. Виявлено різноспрямовані зміни ферментативної активності
комплексів ЕТЛ внутрішньої мітохондріальної мембрани за умов дієтіндукованого стеатогепатозу, в той час як розвиток глутамат-індукованого
стеатогепатозу супроводжувався зниженням ферментативної активності
даних комплексів. За обох досліджуваних моделей стеатогепатозу
відбувалось зниження Н+-АТФазної активності у 1,8 рази (р<0,01).
111
6. Встановлено підвищення вмісту низькомолекулярних білків на
фоні зниження вмісту високомолекулярних білків за умов дієт- і глутаматіндукованого стеатогепатозу.
7. Показано, що введення піоглітазону тваринам з глутаматіндукованим стеатогепатозом приводить до нормалізації деяких показників
структурно-функціонального стану внутрішньої мітохондріальної мембрани.
Маса вісцеральної адипозної тканини у тварин з глутамат-індукованим
стеатогепатозом не знижувалась, проте біохімічні маркери у сироватці крові
щурів відновлювались до контрольних значень