Белоголовых Людмила Александровна. Нитроксидергические механизмы адъювантного артрита

Короткий опис

Белоголовых Людмила Александровна. Нитроксидергические механизмы адъювантного артрита : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.25 / Белоголовых Людмила Александровна; [Место защиты: ГОУВПО "Владивостокский государственный медицинский университет"].- Владивосток, 2006.- 128с.: ил.

ГОУ ВПО ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ «ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ»
На правах рукописи
04 2.00 7 G4433 -
БЕЛОГОЛОВЫХ Людмила Александровна
НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДЪЮВАНТНОГО
АРТРИТА
03 00.25 - гистология, цитология, клеточная биология
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор ШУМАТОВА Татьяна Александровна Научный консультант доктор медицинских наук, профессор МОТАВ КИН Павел Александрович
Владивосток - 2006
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Современные аспекты патогенеза аутоиммунного синовита 11
1.2. Роль N0 в развитии заболеваний опорно¬двигательного аппарата 28
1.2.1. Молекулярные свойства N0 28
1.2.2. Топография NO-синтазы в хряще и синовиальной оболочке сустава 34
1.2.3.Значение N0 в развитии аутоиммунного синовита
и дистрофии хряща 37
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 43
2.1. Материал исследования 43
2.2. Методы исследования 48
2.2.1.Общеморфологический метод 48
2.2.2. Гистохимические исследования 49
2.2.3. Иммуноцитохимические исследования 51
2.2.4. Метод электронной микроскопии 52
2.2.5. Статистическая обработка данных 53
ГЛАВА 3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ И АКТИВНОСТЬ NADPH-
ДИАФОРАЗЫ И NO-СИНТАЗ В СИНОВИАЛЬНОЙ
ОБОЛОЧКЕ И ХРЯЩЕ ТИБИОТАРЗАЛЬНОГО СУСТАВА У ЗДОРОВЫХ МЫШЕЙ 54
3.1. Характеристика синовиальной оболочки 54
3.2. Характеристика хряща 60
ГЛАВА 4. ЛОКАЛИЗАЦИЯ И АКТИВНОСТЬ NADPH-
ДИАФОРАЗЫ И NO-СИНТАЗЫ В СИНОВИОЦИТАХ И ХОНДРОЦИТАХ ПРИ АДЪЮВАНТНОМ АРТРИТЕ ....64
4.1. Характеристика синовиальной оболочки 64
4.2. Характеристика хряща 78
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ПРЕДНИЗОЛОНА И N-НИТРО-Ь-АРГИНИНА
НА НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКУЮ ФУНКЦИЮ
СИНОВИОЦИТОВ 83
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 90
ВЫВОДЫ 103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105
з
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
c-NOS - конститутивная форма нитрооксидсинтазы
DAS - индекс активности заболевания
e-NOS - эндотелиальная нитрооксидсинтаза
IFN-y - интерферон у
IL-1 - интерлейкин - 1
і-NOS - индуцибельная нитрооксидсинтаза
LPS - липополисахарид
NADPH-d - NADPH-диафораза
NFkB - ядерный фактор транскрипции
n-NOS - нейрональная нитрооксидсинтаза
N0 - оксид азота
NOS - нитрооксид синтазы
Th-І -Т-лимфоциты хелперы 1 типа
Th-2 - Т-лимфошпы хелперы 2 типа
TNF-a - фактор некроза опухоли
VGEF - фактор роста сосудистого эндотелия
АА - адъювантный артрит
ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор КА - коллагеновый артрит ОА - остеоартроз
ПАФ - полный адъювант Фрейнда РА - ревматоидный артрит
Актуальность проблемы Проблема аутоиммунного воспаления в клинике внутренних болезней является чрезвычайно важной Аутоиммунные болезни поражают 5-7% населения земного шара, чаще развиваются у женщин, чем у мужчин, как правило, в молодом возрасте и рассматриваются как наиболее частая причина хронической патологии человека [1, 24, 28]
Наиболее яркими представителями системных аутоиммунных болезней являются ревматические заболевания: системная красная волчанка,
ревматоидный артрит, системная склеродермия, дерматополимиозит и полимиозит, гранулематоз Вегенера [49, 67] Развитие аутоиммунных ревматических заболеваний связывают с поликлональной В-клеточной активацией, Т-клеточной активацией антигеном, молекулярной мимикрией, дефектами генов, кодирующих структуру иммуноглобулинов, Т-клеточных рецепторов и синтез цитокинов, нарушением механизмов программированной гибели клеток (апоптоз) [48, 49] Многие современные тенденции в изучении иммунопатогенеза воспалительных ревматических заболеваний можно проследить на примере ревматоидного артрита [49, 63]. Это находит свое отражение в морфологии ревматоидного синовита, который представляет собой классический пример иммунного воспаления [27]
Ревматоидный артрит (РА)- одно из наиболее распространенных хронических аутоиммушшх заболеваний человека, частота которого в популяции достигает 1% [41, 46], а экономические потери от РА для общества сопоставимы с ишемической болезнью сердца К кардинальным признакам РА относится неуклонно прогрессирующее поражение суставов (хронические боли, деформация, нарушение функции), приводящее к инвалидности и снижению продолжительности жизни пациентов [47, 49] Увеличение смертности во многом обусловлено нарастанием частоты сопутствующих заболеваний (инфекции, поражение сердечно-сосудистой системы и почек, остеопоретические переломы и др.), развитие которых патогенетически связано
с плохо контролируемыми ревматоидным воспалением и дефектами иммунитета [48, 80].
Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хронический прогрессирующий синовит, приводящий к постепенной деструкции суставов [20, 41]. Суть патологического процесса при РА составляет прогрессирующее неконтролируемое воспаление синовиальной оболочки суставов, обусловленное резидентными синовиальными клетками фибробластами, макрофагами, дендритными, тучными, эндотелиальными клетками, Т- и В- лимфоцитами [20, 45, 63] Основное значение в патогенезе РА придают двум тесно взаимосвязанным процессам антиген-специфической активации CD4 Т- лимфоцитов по Th-І типу, характеризующейся избыточным синтезом интерлейкина (IL-2), интерферона (IFN-y), IL-17, IL-18, и дисбалансом между продукцией провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли-а (TNF- а), IL-1, IL-6, IL-8 и противовоспалительных цитокинов (IL-10, растворимого антогониста IL-1, растворимых TNF-a рецепторов, IL-4) с преобладанием продукции первых над вторыми [48, 61]. Th-І клетки вовлечены в реакции клеточного иммунитета, а именно гиперчувствительность замедленного типа, воспаление, клегочную цитотоксичность [39, 26, 43]
Именно нарушение синтеза цитокинов лежит в основе патогенеза хронического воспаления при аутоиммунных заболеваниях. По современным представлениям ключевыми медиаторами иммуновоспалительного процесса при РА являются TNF-a и IL-1J} [45, 44, 48, 184] Эти последние регулируют выработку оксида азота (N0), что выдвигает его на передний план патогенетического процесса в синовиальной оболочке По данным экспериментальных исследований, подавление синтеза N0 ассоциируется с уменьшением признаков воспаления при различных формах экспериментальных артритов [179, 191, 198, 199, 191]. Экспрессия
индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и повышенный синтез N0 впервые показаны на моделях органоспецифических аутоиммунных заболеваний in vivo, таких как экспериментальный аллергический энцефаломиелит и иммунологически опосредованный диабет у мышей без признаков ожирения [88, 175] Подобный характер NO-синтазной функции выявлен на модели адъювантного и коллаген-индуцированного артрита у мышей линии MRL// [202] Дебют экспериментального артрита предотвращается введением монометиларгинина - специфического ингибитора iNOS [179, 202, 205] Однако, остается не выясненным, как интенсивность выработки N0 в структурах синовиальной оболочки контролирует напряженность и длительность воспалительного процесса
Анализ литературы показывает недостаточность сведений о нитроксидергической функции синовиальной оболочки в норме и при развитии ревматоидного воспаления Так, концентрация нитритов в синовиальной жидкости значительно превосходит концентрацию нитратов и нитритов в сыворотке крови у больных РА, что указывает на высокий локальный уровень синтеза N0 в суставах, пораженных РА [139, 183]. Известно, что источником N0 в синовиальной жидкости являются гранулоциты [138, 132]. Однако другие типы локальных NO-продуцирующих клеток синовии остаются неизвестны Вместе с тем, гребует уточнения динамика развития токсическою и цитопротективного эффектов N0, притом, что данные об экспрессии NOS в тканях сустава на разных стадиях РА чрезвычайно противоречивы Одни исследователи отводят N0 роль главного организатора хронического воспаления, другие, напротив, ее отвергают [141]. Не известны также топография и динамика активности NOS синовиоцитов на фоне действия основных фармакологических препаратов
Многообразие клинических, патологических и иммунологических проявлений РА делает этот процесс похожим на клинико-иммунологический синдром, чем на одну «гомогенную» болезнь [181] Не случайно РА приобрел статус модели, на которой активно изучаются новые аспекты патогенеза аутоиммунного воспаления и разрабатываются принципиально новые направления противовоспалительной терапии [174]. Выдающееся открытие полного адъюванта Фрейнда дало возможность дальнейшего изучения проявлений клеточного иммунитета при экспериментальном воспроизведении аутоиммунных заболеваний, а именно участия N0 в развитии синовита. Адъювантный артрит мышей напоминает по своему течению и морфологическому проявлению ревматоидный артрит человека [82, 83]. На модели АА планируется уточнить роль NO-синтазной компоненты на разных этапах развития синовиального воспаления.
Цель работы установить значение нитроксидергических механизмов в развитии адъювантного артрита.
В работе решались следующие задачи:
1 Определить локализацию и активность NADPH-диафоразы и N0- синтаз в клетках синовиальной оболочки и хряща тибиотарзального сустава у здоровых мышей линии С57В1аск6
2 Изучить локализацию и активность NADPH-диафоразы и NO-синтаз в синовиоцитах и хондроцитах тибиотарзального сустава на ранней и поздней стадии адъювантного артрига у мышей линии С57В1аск6
3 Исследовать уровень активности NADPH-диафоразы и NO-синтаз в синовиоцитах и хондроцитах тибиотарзального сустава у мышей линии С57В1аск6 с адъювантным артритом на фоне введения специфического ингибитора фермента N-Hmpo-L-аргинина.
4 Изучить влияние преднизолона на активность нитрооксидсинтазы в синовиоцитах и хондроцитах тибиотарзального сустава у мышей линии С57В1аск6 с адъювантным артритом
Научпая новизна н теоретическое значение работы: а) впервые проведен комплексный анализ участия NO-сингазной компоненты в инициации и развитии адъювантного артрита, б) впервые установлена динамика активности NADPH-диафоразы. индуцибельной и конститутивной NO-синтазы в синовиоцитах и хрящевой ткани мышей линии С57В1аск6, дана их детальная количественная характеристика в условиях экспериментального артрита, в) установлено значение блокаторов NO-синтазы и преднизолона на экспрессию нитроксидсинтаз в тканях тибиотарзального сустава у мышей на модели ревматоидного воспаления
Проведенные исследования позволили обосновать и сформулировать научные положения, способствующие пониманию NO-ергических механизмов, лежащих в основе становления и развития адъювантного воспаления Выявленные изменения состояния NADPH-диафоразы, индуцибельной и конститутивной NO-синтазы в синовиоцитах и хондробластах, а также фармакологическая коррекция активности ферментов достаточно объективно свидетельствуют о прямом и неоднозначном влиянии оксида азота на патогенез адъювантного воспаления Это может иметь важное теоретическое значение для разработки новых подходов в понимании патогенетических механизмов ревматоидного артрита у человека
Практическая ценность работы Полученные в работе данные по топографии и реактивности NO-синтезирующих синовиоцитов и хондроцитов в условиях экспериментального артрита могут быть использованы в области клинической и теоретической ревматологии, патофизиологии и патологической анатомии аутоиммунного поражения опорно-двигательного аппарата. Установленная динамика активности NO-синтазы и резистентность синовиоцитов при введении ингибитора энзима и преднизолона может представлять эффективную модель для разработки препаратов направленного действия и надежной фармакологической коррекции патологии суставов при ревматоидном артрите
Положения, выносимые на защиту:
1 Участие NO-содержащих клеточных структур синовиальной оболочки в развитии аутоиммунного артрита определяется их типологической и химической гетерогенностью
2 Динамика активности NOS в синовиоцитах зависит от стадии воспаления и определяет специфическое эффекторное действие N0 на клетки- мишени
3 Степень поражения хрящевой ткани суставов при адъювантном артрите коррелирует с NO-синтетической функцией хондробластов
4 Введение Ы-нитро-Ь-аргинина и преднизолона снижает активность фермента в клеточных элементах синовии
Апробация работы состоялась на кафедре гистологии, цитологии, клеточной биологии ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет М3 РФ» (Владивосток, 2005). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003, Москва 2004), на заседаниях Приморского краевого терапевтического общества (Владивосток, 2001-2003), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 25.09. 2004), Конгрессе европейской противоревматической лиги (EULAR, Берлин. 2004), Конгрессе международной ассоциации по остеоартрозу (OAS1, Чикаго, 2004), в рамках научной сессии ДВО РАН и СО РАМП «Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Владивосток, 2005), Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Владивосток, 2005).

Список літератури

выводы
1. Умеренная активность NADPH-диафоразы установлена в синовиоцитах покровного и стромального слоях синовиальной оболочки у здоровых мышей линии C57BIack6 В субпокровном уровне синовии NADPH-d позитивные клетки отсутствуют Топография NADPH-d совпадает с локализацией конститутивной NOS (c-NOS).
2. Хондроциты и хондробласты тибиотарзального сустава здоровых мышей содержат NADPH-d Высокая активность фермента выявляется в цитоплазме пролиферирующих хондробластов, занимающих краевую зону хряща В средних и глубоких слоях хрящевой ткани интенсивность окрашивания хондроцитов снижается до умеренной и низкой
3. Ранняя фаза адъювантного воспаления характеризуется увеличением на 30,4% числа нитрооксидпозитивных клеток Активность NADPH-диафоразы в клетках синовиальной оболочки определяется на высоком уровне (75,2+3,8 ЕОП). На 30-день адъювантного артрита количество и активность нитрооксидпозитивных клеток снижается
4 В начальной фазе адъювантного артрита количество синовиоцитов, экспрессирующих iNOS постоянно увеличиваегся, достигая максимума на 7-14 день Большинство клеток экспрессирующих i-NOS локализуется в покровном и стромальном слоях синовиальной оболочки
5 Поздняя стадия адъювантного артрита характеризуется значительным уменьшением количества и интенсивности окрашивания i-NOS реактивных элементов, что сопровождается сохранением экспрессии конститутивного изофермента (n-NOS) в синовиоцитах покровного, субпокровного и глубокого стромального уровней синовиальной оболочки
6 В раннюю стадию адъювантного артрита преобладают хондробласты с высокой активностью NADPH-d В позднюю стадию активность фермента и количество нитрооксидпозитивных клеток снижается
7 N-mnpo-L-аргинин тотально блокирует активность NADPH-d, i-NOS и n-NOS в макрофагах и синовиоцитах покровного и субпокровного слоях синовиальной оболочки Активность NADPH-d в стромальном слое прогрессивно уменьшается до низкой
8 Преднизолон снижает активность NADPH-d, i-NOS и c-NOS в клетках глубокого стромального слоя синовиальной оболочки
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Актуальные проблемы патофизиологии (избранные лекции) / Под ред. Б Б Мороза - М.: Медицина, 2001 -424с.
2 Альфа2- макроглобулин в сыворотке и синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом и остеоартрозом / З.Коларов, Р Стоилов, М. Балева К Николов, И Шейтанов и др // Терапевт арх -2000 - Т 72, 35 -С. 17-19.
3. Анализ иммунных нарушений у больных ревматоидным артритом с поражением сердца / В Т.Тимофеев, Г В Порядин, М.В Головизнин, С И. Кондратчик // Патолог физиология и эксперимент терапия - 1998. - №3. -С. 10-12.
4 Арлеевская, М И Клинические и лабораторные признаки нарушенного функционирования иммунной системы у больных ревматоидным артритом и их кровных родственниц / МИ Арлеевская, Н.П. Шил кина, А П Цибулькин // Терапевт арх. - 2005. - № 5. - С.26-29.
5 Барановский, П.В Влияние салазосульфапиридина ( сульфасалазина) на состояние системы комплемента у крыс с адъювантным артритом / П.В Барановский, И.Ю. Высоцкий, М.З. Болюх // Фармакология и токсикология -1989 - Т 52, №1. - С. 65-67.
6 Брюне, Б Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути: обзор / Б Брюне, К. Сандау, А фон Кнетен // Биохимия - 1998. - Т.63, вып.7 - С 966-975.
7. Ванин, А Ф Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы- две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах: обзор / А.Ф Ванин // Биохимия -1998 - Т 63, вып 7. - С 924- 938
8. Ванин, А.Ф Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований / А Ф Ванин // Биохимия -1998.-Т.63, вып 7 - С. 867-869
9 Ванин, А Ф Оксид азота в биомедицинских исследованиях / А Ф Ванин // Вестн. Рос АМН - 2000. -№ 4 - С.- 3-5.
10 Викторов, И В Роль оксида азота и других свободных радикалов в ишемической патологии мозга /ИВ Викторов // Вестн. Рос АМН - 2000.-№4.-С.5-11.
11. Влияние а2Ь- интерферона in vivo и in vitro на функциональную активность Т- лимфоцитов больных ревматоидным артритом / А.А. Ярилина, М Ф Никонова, М М Литвина, Р.М Балабанова, А.А. Ярилин // Терапевт арх - 2000. - № 5. - С.9-17.
12. Влияние бета-каротина на развитие адьювантного артрита и продукцию интерлейкина-1 у крыс / А.А Потапова, О В Буюклинская, Т.Л. Корсова , Н А. Морозова, Л И. Кривое и др // Бюл. эксперимент биологии и медицины -1993 - Т. 116, № 12. -С. 611-613.