Буденкова Екатерина Александровна Способ получения биоэтанола из мискантуса китайского с помощью плесневого гриба Aspergillus niger и дрожжевого консорциума

Короткий опис

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта»

На правах рукописи
Буденкова Екатерина Александровна
Способ получения биоэтанола из мискантуса китайского с помощью плесневого гриба Aspergillus niger и дрожжевого консорциума
1.5.6. Биотехнология
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук
Научный руководитель: доктор технических наук, доцент Кригер Ольга Владимировна
Калининград
2023
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ......................................................................... 3
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................... 8
1.1 Целлюлозосодержащее сырьё и способы предобработки..................................................................... 8
1.2 Микроорганизмы-целлюлолитики и бродильщики 18
1.3 Способы получения биоэтанола............................... 25
1.4 Заключение по обзору............................................... 28
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................................................................ 31
2.1 Организация выполнения работы........................... 31
2.2 Объекты исследований............................................. 33
2.3 Оборудование............................................................. 34
2.4 Методы исследований............................................... 34
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................................ 47
3.1 Анализ химического состава Miscanthus sinensis и определение параметров его
делигнификации............................................................... 47
3.2 Изучение целлюлолитической активности Aspergillus niger 52
3.3 Подбор условий проведения физико-химического мутагенеза Aspergillus niger
и оптимизация параметров гидролиза целлюлозы мискантуса......................................................................... 58
3.4 Подбор эффективного дрожжевого консорциума и определение оптимальных
условий для проведения спиртового брожения.............. 67
3.6 Получение этанола в оптимальных условиях........... 74
ГЛАВА 4 ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................. 79
4.1 Разработка технологической схемы производства биоэтанола......................................................................... 79
4.2 Характеристика биоэтанола..................................... 85
4.3 Расчет ожидаемой экономической эффективности биоэтанола......................................................................... 87
ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................ 90
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ............................................................... 92
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................ 93
Приложение А - МАЛДИ-ТОФ МС щелочной делигнификации............................................................. 111
Приложение Б - МАЛДИ-ТОФ МС кислотной делигнификации............................................................. 112
Приложение В - Технологическая инструкция............ 113
Приложение Г - Акт промышленной апробации......... 114

Список літератури

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Изучен химический состав трех сортов Miscanthus sinensis, в результате чего определено, что наименьшее количество лигнина содержится в Miscanthus sinensis сорта «Zebrinus». Содержание целлюлозы статистически значимо не отличается в трех исследуемых сортах M. sinensis. В пределах сорта «Zebrinus» наибольший выход целлюлозы отмечен в случае использования целого растения.
Выявлены оптимальные условия делигнификации биомассы: варка в присутствии пертрифторуксусной кислоты при 60 °С в течение 60 мин (кислотная делигнификация) или обработка гидроксидом натрия при температуре 80 °С в течение 180 мин (щелочная делигнификация).
2. Наибольший выход редуцирующего вещества при проведении ферментативного гидролиза с использованием нативного Aspergillus niger F - 1270 составил 1,0 ± 0,2 г/л. Подобраны условия проведения физико­химического мутагенеза A. niger F-1270 с целью улучшения целлюлолитических свойств: споры 5-суточной культуры A. niger облучать УФ (253,7 нм) на расстоянии 60 см от лампы в течение 120 мин; чашку с суспензией инкубировались в темноте при 28 °С в течение ночи; суспензию спор смешать с раствором азид натрия/бромид этидия в соотношении 9:1 и инкубировать в течение 30 мин, трехкратно промыть суспензию спор буферным раствором и культивировать на чашке с питательной средой при 28 °С в течение двух недель.
В результате ненаправленного мутагенеза получены новые образцы A. niger, обладающие статистически значимо более высоким целлюлолитическим потенциалом.
3. Подобраны условия для проведения ферментативного гидролиза с использованием штамма A. niger №2 (120 мин УФ облучения A. niger): кислотная делигнификация биомассы, цитратный буфер с рН 5,0, концентрация субстрата 50 г/л, температура 36 °С, без перемешивания. Условия для проведения ферментативного гидролиза с использованием штамма A. niger №3 (последовательное УФ облучение (120 мин) и обработка химическим мутагеном в течение 30 мин): щелочная делигнификация биомассы, цитратный буфер с рН 5,0, концентрация субстрата 200 г/л, температура 42 °С, постоянное перемешивание 75 об/мин.
Оптимизированный состав реакционной среды: NaNO3 - 3 г/л; KH2PO4 - 0,35 г/л; K2HPO4*3H20 - 0,1 г/л; MgSO4*7H2O - 0,5 г/л; KCl - 0,5 г/л; FeSO4*7H2O - 5,0 мг/л; MnSO4*7H2O - 1,6 мг/л; ZnSO4*7H2O - 1,4 мг/л; CoCl2*6H2O - 20 мг/л. Продолжительность культивирования 14 суток.
4. Сформирован консорциум дрожжевых микроорганизмов (Schefferomyces stipites Y-3263, Pachysolen tannophilus Y-3269, Saccharomyces cerevisiae Y-4242, Lanchancea thermotolerans Y-4532). Оптимизирован солевой состав среды для проведения реакции спиртового брожения дрожжевым консорциумом с помощью полного факторного двухуровневого эксперимента: NaNO3 - 3 г/л; X2 - K2HPO4 - 3,50 г/л; X3 - NH4Q - 1,50 г/л; X4 - NaCl - 1 г/л; FeSO4*7H2O - 5,0 мг/л; MnSO4*7H2O - 1,6 мг/л; ZnSO4*7H2O - 1,4 мг/л; CoCl2*6H2O - 20 мг/л.
5. Получен этанол-сырец с объемной долей этанола 96,4±4,8%. Анализ физико-химических свойств полученного биоэтанола показал его соответствие стандарту качества, установленного для технического этанола.
6. Разработана технологическая схема и технологическая инструкция по получению этанола путем биоконверсии травянистого растения Miscanthus sinensis «Zebrinus» с использованием плесневого гриба Aspergillus niger и дрожжевого консорциума (ТИ 20.14.75-001-02068255-2023), апробированная в «Русэкстракт».
7. Рассчитана экономическая эффективность производства биоэтанола согласно описываемой технологической схемы.