Франскевич Дар’я Володимирівна Біохімічні механізми комбінованої дії цисплатину та фуле- рену С60 на нормальні та злоякісно трансформовані клітини

Короткий опис

Франскевич Дар’я Володимирівна, тимчасово не працює: «Біохімічні механізми комбінованої дії цисплатину та фуле- рену С60 на нормальні та злоякісно трансформовані клітини» (03.00.04 - біохімія). Спецрада Д 26.001.24 у Київському на­ціональному університеті імені Тараса Шевченка

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
ФРАНСКЕВИЧ ДАР’Я ВОЛОДИМИРІВНА
УДК: 576.32/36.+546.264+615.277.3
БІОХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ КОМБІНОВАНОЇ ДІЇ ЦИСПЛАТИНУ ТА
ФУЛЕРЕНУ С60 НА НОРМАЛЬНІ ТА ЗЛОЯКІСНО ТРАНСФОРМОВАНІ
КЛІТИНИ
03.00.04 - біохімія
Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник
МАТИШЕВСЬКАОльга Павлівна
доктор біологічних наук, професор
Київ – 2017
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ…………..………………….....………...…..6
ВСТУП…………………………………………………………...…………………...7
РОЗДІЛ 1. РОЛЬ АКТИВНИХ ФОРМ КИСНЮ ТА ІОНІВ Ca У СИГНАЛЬНИХ
ШЛЯХАХ АПОПТОЗУ ………..……………………………………………........ 12
1.1. Характеристика активних форм кисню…………………..…..13
1.2. Характеристика компонентів системи Сa2+
сигналювання у
незбудливих клітинах….……………………………............ 17
1.3. Особливості підтримання кальцієвого гомеостазу та рівня
АФК у пухлинних клітинах ………………………………..22
РОЗДІЛ 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИСПЛАТИНУ ТА ШЛЯХІВ РЕАЛІЗАЦІЇ
ЙОГО ПРОТИПУХЛИННОЇ ДІЇ…………………...…. …………………………27
2.1 Властивості цисплатину та шляхи його надходження у
клітину………………………………………………………………..27
2.2 Ефекти цисплатину на ядерному та позаядерному
рівнях…………………………………………………………………29
2.3 Біохімічні механізми розвитку резистентності пухлинних
клітин до цисплатину …………………………………………….....31
РОЗДІЛ 3. ФУЛЕРЕН С60 – БІОЛОГІЧНО АКТИВНИЙ ПРЕДСТАВНИК
КАРБОНОВИХ НАНОСТРУКТУР……………………………………………....35
3.1. Особливості будови, властивості та біологічна дія фулерену
С60 ………....................……………………………………………….35
3.2. Ефекти комбінованої дії фулерену С60 та протипухлинних
препаратів ………………………………………….………………...39
3
РОЗДІЛ 4. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ ………………………42
4.1. Реактиви…………………………….…………………..…...….42
4.2.оОтримання нормальних та лейкемічних клітин……..…….…42
4.3. Характеристика колоїдного розчину фулерену С60………….43
4.4. Умови фотозбудження фулерену С60 ……………………...… 44
4.5. Умови постановки експериментів …………………………....44
4.6. Оцінка життєздатності клітин з використанням МТТ……... 45
4.7. Оцінка продукування АФК у клітинах …….………………...45
4.8. Визначення концентрації вільного цитозольного Са2+
у
клітинах………………………..………...…………………….……..46
4.9.оОцінка входу Са2+ у клітини за ємнісним механізмом …...…46
4.10. Реєстрація мембранного потенціалу мітохондрій у
клітинах…………………………………………………………...….47
4.11. Оцінка кінетики гемолізу еритроцитів щура ……….…….…47
4.12. Отримання клітинних лізатів ………………………………...47
4.13. Електрофорез протеїнів в ПААГ ………………………….....48
4.14. Вестерн блот аналіз з використанням антитіл до фосфо-р38
МАРК ……………………………………………………...…....…...48
4.15. Аналіз розподілу клітин за фазами клітинного циклу ….….49
4.16. Статистична обробка даних …………………..………….......50
РОЗДІЛ 5. ПОКАЗНИКИ ТОКСИЧНОЇ ДІЇ ЦИСПЛAТИНУ У НИЗЬКИХ
КОНЦЕНТРАЦІЯХ НА КЛIТИНИ ЛІНІЇ L1210………………….. 51
РОЗДІЛ 6. ПРОНИКНЕННЯ ФУЛEРEНУ С60 У КЛIТИНИ ЛІНІЇ
L1210......................................................................................................55
РОЗДІЛ 7. ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ КЛІТИН ЛІНІЇ L1210 ТА ПРОДУКУВАННЯ
АФК ЗА КОМБІНОВАНОЇ ДІЇ ФУЛЕРЕНУ С60 ТА
ЦИСПЛАТИНУ……………………………………………………….58
4
РОЗДІЛ 8. ЗAХИСНI EФEКТИ ФУЛEРEНУ С60 ЗА ДIЇ ЦИСПЛAТИНУ НА
НОРМАЛЬНІ КЛІТИНИ ………...………………………………......60
8.1. Стійкість еритроцитів до гемолізу за дії цисплатину та
фулерену С60 ………………………………….…………………..…..60
8.2. Продукування АФК у тимоцитах за дії цисплатину та фулерену
С60 ………….…………………………...……………………………...62
РОЗДІЛ 9. ВПЛИВ ЦИСПЛAТИНУ НA ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ РIЗНИХ ЗA
ЧУТЛИВIСТЮ ДО ПРEПAРAТУ ЛEЙКEМIЧНИХ КЛIТИН...........66
9.1. Морфологічна хaрaктeристикa чутливих тa рeзистeнтних до дiї
цисплaтину лeйкeмiчних клiтин ………………………………… 66
9.2. Життєздатність клітин L1210 та L1210R за дії цисплатину у
різних концентраціях ………………………...……………………68
РОЗДІЛ 10.ЖИТТЄЗДAТНIСТЬ ТА РОЗПОДІЛ ЗА ФАЗАМИ КЛІТИННОГО
ЦИКЛУ ЛЕЙКЕМІЧНИХ КЛIТИН ЗA КОМБІНОВАНОЇ ДIЇ
ФОТОЗБУДЖЕНОГО ФУЛEРEНУ С60 ТА ЦИСПЛАТИНУ ..........71
10.1. Життєздaтнiсть клiтин L1210 тa L1210R зa дiї досліджуваних
чинників……………………..………………………………….…. 71
10.2. Розподіл лейкемічних клітин за фазами клітинного циклу за дії
досліджуваних чинників …………...........……………...…………74
РОЗДІЛ 11.РАННІ МЕХАНІЗМИ ТОКСИЧНОЇ ДІЇ КОМБІНАЦІЇ
ФОТОЗБУДЖЕНОГО С60 ТА ЦИСПЛАТИНУ НА ЛЕЙКЕМІЧНІ
КЛІТИНИ……...……………………………………………………....78
11.1. Aктивнiсть р38 МAРК у лeйкeмiчних клiтинaх зa дiї
фотозбуджeного С60……………………….……….………..…….78
11.2. Концeнтрaцiя вiльного цитозольного Сa2+ у лейкемічних
клiтинaх зa дiї досліджуваних чинників ………………...…….....80
5
11.3. Продукувaння AФК у лeйкeмiчних клiтинaх зa дiї
досліджуваних чинників ……………………………………......... 83
11.4. Оцінка ємнiсного входу Сa2+ у лейкемічні клiтини ….……….86
11.5. Вeличинa ємнiсного входу Сa2+ у лейкемічні клiтини зa дiї
досліджуваних чинників …………………………..………………89
11.6. Величина мембранного потенціалу мітохондрій у лейкемічних
клітинах за дії досліджуваних чинників ……………………...….92

УЗАГАЛЬНЕННЯ……..………………………………………...………………... 95
ВИСНОВКИ………………………………………………………………..….......105
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ……………………………….………..107
6
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АОС – антиоксидантна система
АФК – активні форми кисню
ЕПР – ендоплазматичний ретикулум
ЕТЛ – електрон-транспортний ланцюг
ПМ – плазматична мембрана
СОД – супероксиддисмутаза
[Ca2+]i – концентрація вільного цитозольного Са2+ в клітинах
сis-Pt – цисплатин
DCFН-DA – 2,7-дихлордигідрофлуоресцеїн діацетат
FCCP – карбонілу ціаніду-п-трифлуореметоксифенілгідразону
GSH – відновлена форма глутатіону
IP3R – рецептори до 1,4,5-інозитолтрифосфат
МАРК – мітоген-активуюча протеїнкіназа
MDR – множинна стійкість до лікарських препаратів (multiple drug
resistance)
MRP – протеїни асоційовані з множинною стійкістю до лікарських
препаратів (multidrug resistance protein)
NOX – НАДФН-оксидази
PMCA – Cа
2+
-АТРаза плазматичної мембрани
РТР – мітохондріальна пора транзієнтної проникності
SERCA – Са2+
-АТРаза ендоплазматичного ретикулуму
SOCC – Са2+
-канали ємнісного шляху
SOCE – ємнісний вхід Са2+ у клітину
TMRE – тетраметилродаміну етил естеру перхлориду
TRPC – канали транзієнтного рецепторного потенціалу
VDAC – потенціал-залежні аніонні канали зовнішньої мембрани
мітохондрій
VDСC – потенціал-керовані Са2+
-канали
7
В С Т У П
Актуальність теми. Останнім часом увагу дослідників привертають ті
компоненти сигнальних шляхів, які регулюються активними формами кисню
(АФК) та іонами Са, що пов’язано із залученням цих вторинних посередників
до контролю не лише проліферації, але й апоптозу [57, 264]. Пригнічення
сигнальних шляхів апоптозу є одним з основних механізмів забезпечення
життєздатності злоякісно трансформованих клітин за дії протипухлинних
препаратів. Тому актуальною є розробка підходів до активації сигнальних
шляхів, спрямованих на селективне посилення апоптичного потенціалу
пухлинних клітин без ушкодження нормальних клітин.
Одним з таких підходів є застосування декількох протипухлинних агентів,
що у комбінації підвищують цитотоксичну дію на злоякісно трансформовані
клітини. Вважається, що основним механізмом дії протипухлинного препарату
цисплатину (cis-Pt) є утворення ДНК аддуктів. Проте, накопичено дані, що
свідчать про позаядерні механізми токсичної дії цисплатину, пов’язані,
зокрема, з окисною модифікацією тіолових груп глутатіона та протеїнів,
порушенням антиоксидантного та прооксидантного балансу [26, 52, 68, 80].
Незважаючи на високу ефективність цисплатину, його використання у
терапевтичних дозах обмежується токсичною дією на нормальні клітини та
розвитком резистентності у пухлинних клітинах, яка виникає за декількома
механізмами, зокрема, шляхом інгібування входу та активації виходу препарату
з клітини [43, 106, 232], його інактивації внаслідок дії внутрішньоклітинних
тіолів [26, 54, 80].
На сьогодні значна увага дослідників направлена на розробку підходів до
подолання резистентності пухлинних клітин через використання комбінації
протипухлинних препаратів з фулереном С60. Фулерен С60 – представник
карбонових наноструктур, що не є токсичним у концентраційному діапазоні
10
-6 М – 10-4 М [74, 131, 228] та виявляє біологічну активність завдяки
8
особливостям будови молекули. Нанорозмірність, сферична форма та
ліпотропність, наявність системи π-кон’югованих подвійних зв’язків на
поверхні молекули фулерену С60 зумовлюють його мембранотропність,
антиоксидантні властивості у незбудженому стані [15, 88, 188] та здатність до
ефективного продукування токсичних АФК у разі фотозбудження молекули
[109, 163, 250], що відкриває перспективи його використання як
фотосенсибілізатора для фотодинамічної терапії.
У системах in vitro та in vivo показано, що комбінація похідних С60 з
протипухлинними препаратами (цисплатином, доксорубіцином, паклітакселом)
пригнічує виживаність пухлинних клітин та знижує кардіо- та
нефротоксичність [23, 135, 155]. Зважаючи на те, що модифікація структури
фулерену С60 через порушення системи π-кон’югованих подвійних зв’язків
спричиняє зміни у фізико-хімічних властивостях наноструктури [19, 107, 239],
актуальним є дослідження дії немодифікованого фулерену С60 у комбінації з
протипухлинними препаратами на злоякісно трансформовані та нормальні
клітини.
У попередніх дослідженнями встановлено, що за дії фотозбудженого у
діапазоні 300-600 нм фулерену С60 у лейкемічних клітинах Jurkat виявляються
ознаки апоптозу – активація каспази -3 [172] та вихід цитохрому с [92]. Це
дозволяє припустити можливість використання комбінацї фотоактивованого
фулерену С60 з цисплатином для посилення ефективності дії протипухлинного
препарату через вплив на сигнальні шляхи, залучені до індукції загибелі
пухлинних клітин та до розвитку резистентності до протипухлинних
препаратів. Описане вище стало основою для формування мети та постановки
задач дослідження даної дисертаційної роботи.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційну роботу виконано на кафедрі біохімії ННЦ «Інститут біології та
медицини» Київського національного університету імені Тараса Шевченка у
рамках науково-дослідних тем: «Механізми реалізації адаптаційно –
компенсаторних реакцій організму за умови розвитку різних патологій» ( № д/р
9
0111U004648, 2011 – 2015 роки) та «Механізми регуляції метаболічних
процесів в організмі за умов розвитку патологічних станів» (№ д/р
0116U002527, 2016 – 2018 роки).
Мета та задачі дослідження. Мета роботи – з’ясувати можливість
модуляції токсичних ефектів цисплатину у низьких дозах на нормальні та
лейкемічні клітини за дії фулерену С60.
Відповідно до поставленої мети було сформульовано наступні завдання:
1. Дослідити проникнення фулерену С60 у лейкемічні клітини лінії L1210.
2. Оцінити вплив цисплатину у низьких концентраціях (1 та 5 мкг/мл) на
нормальні клітини – еритроцити (за їх гемолізом) та тимоцити (за
продукуванням АФК) у контролі та за преінкубації з С60.
3. Оцінити пролонговану дію комбінації фотозбудженого С60 та цисплатину
на чутливі (L1210) та резистентні (L1210R) до цисплатину лейкемічні клітини
за такими показниками, як виживаність та розподіл за фазами клітинного
циклу.
4. З’ясувати ранні біохімічні механізми дії фотозбудженого С60 окремо або
у комбінації з цисплатином на клітини L1210 та L1210R за такими
показниками як продукування АФК, активність кінази р38, рівень
цитозольного Са2+, величина мітохондріального потенціалу.
5. Охарактеризувати параметри Са2+
- депонування у клітинах L1210 та
L1210R за величинами Са2+
-пулу ЕПР та ємнісного входу Са2+ у контролі та за
комбінованої дії фотозбудженого фулерену С60 та цисплатину.
Об’єкт дослідження – біохімічні механізми комбінованої дії цисплатину
та фулерену С60 (у незбудженому та фотоактивованому станах) на нормальні
та злоякісно трансформовані клітини.
Предмет дослідження – продукування АФК, концентрація цитозольного
Са2+, ємнісний вхід Са2+, мембранний потенціал мітохондрій, активність
кінази р38, клітинний цикл.
Методи дослідження: спектрофотометричні методи (МТТ тест, оцінка
гемолізу еритроцитів), спектрофлуориметричні методи з використанням
10
зондів indo-1AM, DCFH-DA, TMRE, Вестерн-блот аналіз активності кінази
р38, протокова цитофлуориметрія (аналіз клітинного циклу), світлова та
конфокальна мікроскопія, культивування клітин.
Наукова новизна одержаних результатів. Виявлено, що фулерен С60
запобігає спричиненим цисплатином гемолізу еритроцитів та продукуванню
АФК у тимоцитах. З використанням флуоресцентно-міченого С60 (С60 – RITC)
доведено накопичення наноструктури у лейкемічних клітинах. За умови
фотозбудження у видимому діапазоні поглинутого фулерену С60 виявлено його
фототоксичний ефект не тільки у чутливих, але й у резистентних до дії
цисплатину лейкемічних клітинах L1210. Вперше продемонстовано, що
цитотоксична дія фотозбудженого фулерену С60 та цисплатину у разі їх
поєднання значно посилюється, спричиняючи інтенсифікацію продукування
АФК, значне підвищення концентрації вільного цитозольного Са2+, активацію
механізму ємнісного входу Са2+, падіння мітохондріального потенціалу як у
чутливих, так і резистентних до цисплатину клітинах лінії L1210 та призводячи
до їх накопичення у проапоптичній SubG1 фазі клітинного циклу. Вперше
показано, що комбінація фотозбудженого фулерену С60 та цисплатину через
модуляцію АФК-чутливих сигнальних шляхів дозволяє активувати механізми
загибелі лейкемічних клітин та відновити чутливість резистентних клітин до дії
цисплатину у низькій концентрації.
Практичне значення одержаних результатів. Дані щодо послаблення
токсичної дії цисплатину на нормальні клітини за умови їх преінкубації з
фулереном С60 вказують на можливість застосування наноструктури як
цитопротектора. Виявлений токсичний ефект фотозбудженого С60 та дані щодо
посилення дії цисплатину у низькій дозі за комбінації з фотозбудженим С60 як у
чутливих, так і у резистентних до цисплатину лейкемічних клітинах, свідчать
про перспективність застосування фулерену С60 для фотодинамічної терапії та
для розробки підходів до подолання стійкості пухлинних клітин до дії
протипухлинних препаратів.
11
Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проаналізовано
наукову літературу за темою наукового дослідження, інтерпретовано отримані
експериментальні результати, здійснено їх статистичну обробку, оформлено
рисунки та таблиці. Експериментальна частина дисертаційної роботи була
виконана здобувачем особисто або за його безпосередньої участі. Автор щиро
вдячний д.б.н., проф. Дробот Л.Б., к.б.н. Пасічник Г.В., к.б.н. Петухову Д.М.
(Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України), к.б.н., ст.н.сп. Гринюк І.І.,
к.б.н., ст.н.сп. Прилуцькій С.В. за допомогу у проведенні експериментів,
результати яких представлено у спільних публікаціях. Головна ідея та задачі
досліджень були сформульовані науковим керівником – д.б.н., проф.
Матишевською О. П.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, отримані в
рамках виконання дисертаційної роботи, представлені у вигляді тез, усних і
стендових доповідей на вітчизняних та міжнародних наукових конференціях,
зокрема, 4-му з'їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним
представництвом (Ужгород, Україна, 2014), ХІ Українському біохімічному
конгресі (Київ, Україна, 2014), Third International Conference on Radiation and
Applications in Various Fields of Research (Budva, Montenegro, 2015), 22nd
International Student Congress of (Bio)Medical sciences (Groningen, Netherlands,
2015), 40th FEBS CongressThe Biochemical Basis of Life (Berlin, Germany, 2015),
Ukrainian – Germany Symposium on Physics and Chemistry of Nanostructures and
on Nanobiotechnology (Kyiv, Ukraine, 2015), 4th International research and practice
conference Nanotechnology and Nanomaterials NANO 2016 (Lviv, Ukraine, 2016).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць: 5 статей
у фахових виданнях, з яких 3 публікації у виданнях, включених до
міжнародних наукометричних баз, та 10 тез доповідей у матеріалах
міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій, конгресів та з’їздів.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів власних
досліджень та їх обговорення, узагальнення, висновків, списку використаних
джерел літератури (266 посилань). Роботу викладено на 134 сторінках та
проілюстровано 29 рисунками та 4 таблицями.

Список літератури

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі досліджено біохімічні механізми дії цисплатину у
комбінації з фулереном С60 у незбудженому та фотоактивованому станах на
нормальні та злоякісно трансформовані клітини. Виявлено протекторний ефект
фулерену С60 від токсичної дії цисплатину на нормальні клітини. Встановлено,
що за комбінації фотозбудженого С60 та цисплатину вдається підвищити
цитотоксичну активність цисплатину у низькій дозі не лише у чутливих, але й у
резистентних до препарату лейкемічних клітинах. Отримані дані є свідченням
перспективності застосування фулерену С60 як фотосенсибілізатора для
фотодинамічної терапії та для розробки підходів до подолання стійкості
пухлинних клітин до дії протипухлинних препаратів.
1. З використанням флуоресцентно-міченого С60 (С60 – RITC) доведено
поглинання та накопичення наноструктури лейкемічними клітинами
лінії L1210 впродовж 18 год інкубації.
2. Цисплатин за низьких концентрацій (1 та 5 мкг/мл) посилює гемоліз
еритроцитів та спричиняє підвищення рівня АФК у тимоцитах. За
преінкубації клітин з С60 показники нормалізуються, що свідчить про
захисний ефект фулерену С60 від токсичної дії препарату на нормальні
клітини.
3. За умови фотозбудження (410-700 нм) поглинутого фулерену С60
виявлено його токсичний ефект як у чутливих (L1210), так і у
резистентних (L1210R) до цисплатину лейкемічних клітинах. За дії
фотозбудженого С60 життєздатність клітин ліній L1210 та L1210R
знижувалась до рівня 59±3% та 54±4% від контролю через 72 год
відповідно.
4. Показано, що за комбінованої дії фотозбудженого фулерену С60 (10-5
М) та цисплатину у низькій концентрації (1 мкг/мл) токсичний ефект
протипухлинного препарату у клітинах L1210 посилюється, а у
106
клітинах L1210R – відновлюється. Показниками пролонгованої
токсичної дії комбінації фотозбудженого С60 та цисплатину є більш
значне, ніж за окремої дії чинників, зниження життєздатності клітин,
та їх накопичення у проапоптичній SubG1 фазі.
5. Ранніми біохімічними механізмами токсичної дії комбінації
фотозбудженого С60 та цисплатину є посилення продукування АФК,
активація редокс-чутливої кінази р38, значне підвищення [Са2+]i
,
дисипація мембранного мітохондріального потенціалу.
6. У резистентних до цисплатину лейкемічних клітинах величина входу
Са2+ за ємнісним механізмом порівняно з чутливими клітинами є
нижчою. За комбінованої дії фотозбудженого С60 та цисплатину у
клітинах обох ліній посилюється як ємнісний вхід катіона через
плазматичну мембрану, так і його вивільнення з внутрішньоклітинних
депо.