Инженерия гомотримерных фибриллярных белков Мирошников, Константин Анатольевич

Короткий опис

Мирошников,КонстантинАнатольевич.Инженериягомотримерныхфибриллярныхбелков: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 1999. - 116 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
ФОССЙЙСКАЙ М А Д Р М И Я НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А Н . БАХА на правах рукописи МИРОПШИКОВКОНСТАНТИНАНАТОЛЬЕВИЧИНЖЕНЕРИЯГОМОТРИМЕРНЫХФИБРИЛЛЯРНЫХБЕЛКОВДиссертация на соискание ученой степени Кандидата биологических наук 03.00.03 - молекулярная биология 03.00.04-биохимия Научный руководитель:

стр. 8
фолдинга существенно сдерживает дизайнбелковыхмолекул de novo в биотехнологии ибелковойинженерии[4]. Известно, что процесс пространственной укладкибелкарегулируетсябелками-помощниками (шаперонами) [42], которые стабилизируют частично собранные интермедиаты. При создании рекомбинантных биологически активных

стр. 100
фолдона фибритина, расположенного на С-конце химерной молекулы. Обнаружена зависимость растворимости и стабильности такихбелковот соответствия диаметров стыкуемыхфибриллярныхбелков. 5. Показана принципиальная возможность создания химерныхбелков, содержащихфибриллярныйобладает как и глобулярный

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Мирошников, Константин Анатольевич
Список сокращений
Глава I. Введение
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цели и задачи исследования
1.3. Научная новизна и практическая ценность
1.4. Основные положения, выносимые на защиту
1.5. Апробация работы
I.7. Объем и структура работы
Глава П. Обзор литературы
II. 1. Фибриллярные адгезины бактериофага Т4.
II. 1.1. Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ)
II. 1.1.1. Функциональная роль 11 II. 1.1.2. Характеристика белкового комплекса длинных хвостовых фибрилл 12 II. 1.1.3. Структурная характеристика белков длинных хвостовых фибрилл
II. 1.2. Короткие хвостовые фибриллы (КХФ)
II. 1.2.1. Функциональная роль
II. 1.2.2. Молекулярная организация
II. 1.3. Фибритин бактериофага Т
II. 2. Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT): модель для изучения фолдинга белка и стабилизации структуры
II. 3. Бета-спиральные белки
II.3.1. Общие сведения о |3-спиральных белках
11.3.2. Свойства ß-спиральной структуры
11.3.3. Факторы стабилизации ß-спиральной структуры
11.3.4. Петли и спирали как минорные элементы ß-спиральных белков. Роль этих участков в функциональной активности белка
11.3.5. Предполагаемые белки с ß-спиральной структурой и их функции
Глава Ш. Материалы и методы
III. 1 Бактериальные штаммы
111.2 Среды для выращивания бактерий
111.3 Векторы для клонирования. Плазмиды 54 III. 4 Ферменты 59 III. 5 Полимеразная цепная реакция 59 III.6 Выделение и очистка ДНК
111.6.1. Очистка амплифицированных фрагментов
111.6.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК
111.6.3. Очистка линеаризованной плазмидной ДНК 62 III. 7 Приготовление компетентных клеток Е. coli 63 III. 8 Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК 63 III. 9 Селекция клонов, содержащих рекомбинантные
Плазмиды
III. 10 Экспрессия клонированных генов в Е. coli 64 III. 11 Проверка экспресии в клетках и растворимости синтезированных белков
III. 12 Выделение и очистка белков
III. 12.1. Выделение растворимых белков
III. 12.2. Очистка белков на основе фибритина ES
III. 12.3. Очистка белков на основе фибритина ТВ 1 67 Ш.12.4.0чистка рекомбинантных белков gpl2N2 и gpl2N3. 67 III. 12.5. Очистка растворимого рекомбинантного белка gpl2N4.
III. 12.6. Выделение и рефолдинг белка gpl2Nl
III. 12.7. Очистка белка gpl2FN 69 III. 12.8. Выделение белков gpAd-FA, gpAd-FB, gpAd-FC
III. 12.9. Выделение и очистка белка CAT-FbrE
III. 13. Определение концентрации белка
III. 14. Определение олигомерности белка
III. 15. Ограниченный протеолиз
III. 16. Спектроскопия кругового дихроизма (КД)
III. 17. Электронная микроскопия
Глава IV. Результаты исследования и их обсуждение
IV. 1. Клонирование и экспрессия фрагментов генов 12 и 37 бактериофага Т
ГУ.2. Выделение, очистка и исследование растворимых делеционных мутантов gpl2M-gpl2N
IV.3. Конструирование химерных белков, содержащих фрагменты gpl2, gp34 и gp37 бактериофага Т4 в качестве С-концевого продолжения фибритина
ГУ.3.1. Выделение, очистка и свойства химер на основе фибритина Е с переходным сайтом НрМ (серия конструкций р¥Е8)
IV.3.2. Выделение, очистка и свойства химер на основе фибритина В1 с переходным участком, включающим участок атаки протеиназами и сайт ВатШ (серия конструкций pWTBl)
IV.3.3. Свойства химер на основе полноразмерного фибритина J с переходным сайтом ВатШ. (серия конструкций pWJ)
IV.3.4. Выделение, очистка и свойства химер на основе фолдона фибритина (фибритина Y) с переходным сайтом ВатШ (серия конструкций pWY)
IV.4. Конструирование и исследование химерных белков, содержащих фрагменты gpl2 и gp37 бактериофага Т4 и белка хвостового шипа аденовируса в качестве N-концевого продолжения фолдона фибритина
IV. 5. Конструирование и исследование химерного белка, содержащего глобулярный и фибриллярный домены, CAT-FbrE
V. Выводы