Изучение биологических активностей мутантных форм белка р53 Пугачева, Елена Николаевна

Короткий опис

Пугачева,ЕленаНиколаевна.Изучениебиологическихактивностеймутантныхформбелкар53: диссертация ... кандидатабиологическихнаук : 03.00.03. - Москва, 1999. - 148 с.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
Р О С С И Й С К А Я А К А Д Е М И Я НАУК И Н С Т И Т У Т М О Л Е К У Л Я Р Н О Й Б И О Л О Г И И ИМ.В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА На правах рукописи УДК 577.218ПУГАЧЕВАЕленаНиколаевнаИЗУЧЕНИЕБИОЛОГИЧЕСКИХАКТИВНОСТЕЙМУТАНТНЫХФОРМБЕЛКАР53 03.00.03 - молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени

стр. 3
Системы деградации р53. 1.5.Биологическиеактивностимутантныхформбелкар53. 1.5.1. Кооперациямутантногобелкар53 с онкогенами. 1.5.2. Участиемутантногор53 в иммортализации клеток. 1.5.3. Позитивная регуляция синтеза ДНКмутантнымбелкомр53. 1.5.4. Взаимодействиемутантногор53 сбелкамитеплового шока. 1.5.5. Специфическое связываниемутантногор53 с рядом клеточнькбелков. 1.5.6....

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Пугачева, Елена Николаевна
Содержание 1
Список сокращений
1. Обзор литературы.
Введение. 6
1.1 Общая характеристика антионкогена р53.
1.1.1. Молекулярная организация гена р53.
1.1.2. Мутации гена р53 в опухолях человека. 8
1.1.3. Доменная организация белка р53. 10
1.1.4. Рентгеноструктурный анализ р53. 11
1.2. Биологические активности белка р53. 12
1.2.1. Белок р53 транскрипционный активатор и репрессор. 14
1.2.2.Участие р53 в регуляции сверочных точек клеточного цикла.
1.2.2.1. Регуляция G1/S перехода клеточного цикла. Р53-зависимый Gl арест. 18
1.2.2.2. Р53-зависимый G2 арест. 25
1.2.3. Гены-мишени р53 и р53-зависимого апоптоза. 26
1.2.4. Гены-мишени р53, функция которых не выяснена. 42
1.3. Активация и ингибирование транскрипционного фактора - р53.
1.3.1. Взаимодействие с клеточными белками Mdm2, JNK, WT1 и ATM. 43
1.3.2. Коактиваторы р53. 50
1.3.3. Взаимодействие р53 с вирусными онкобелками. 52
1.3.4. Пострансляционные модификации р53. 54 1.3.4.1. Фосфорилирование. 54
1.3.4.2. Ацетилирование р53. 56
1.4. Системы деградации р53. 57
1.5. Биологические активности мутантных форм белка р53.
1.5.1. Кооперация мутантного белка р53 с онкогенами. 58
1.5.2. Участие мутантного р53 в иммортализации клеток.
1.5.3. Позитивная регуляция синтеза ДНК мутантным белком р53. 60
1.5.4. Взаимодействие мутантного р53 с белками теплового шока. 61
1.5.5. Специфическое связывание мутантного р53 с рядом клеточных белков. 62
1.5.6. Взаимодействие мутантных форм белка р53 с ДНК. 63
1.5.7. Характеристика трансактивирующих активностей мутантных форм р53. 64
1.6. Конформации мутантных форм белка р53. 68
1.7. Мутантный р53-доминантный или рецессивный онкоген. 70
1.8. Стабилизация мутантного белка р53. 72
1.9. Субклеточная локализация белка р53. 73-74 2. Материалы и методы
2.1. Культивирование клеточных линий.
2.2. Получение панелей линий клеток человека и мыши, экспрессирующих р53 дикой и мутантных форм под контролем гормон-зависимого или тетрациклин-регулируемого промотора. 75
2.3. Иммунопреципитация. 76
2.4. Фракционирование белков в полиакриламидном геле. 77
2.5. Перенос белков из гелей на нитроцеллюлозные фильтры и иммунодетекция р53.
2.6. Бактериальные штаммы, плазмиды, ретровирусные вектора. 78
2.7. Получение компетентных клеток DH5.
2.8. Выделение плазмидной ДНК.
2.8.1. Препаративное выделение плазмидной ДНК 79
2.8.2. Аналитическое выделениеплазмидной ДНК. 80
2.9. Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами.
2.10. Фракционирование ДНК в агарозных гелях. 81
2.11. Извлечение ДНК из агарозных гелей.
2.12.Субклонирование фрагментов ДНК в вектора pPS-neo, pSIT-neo, pMMTV.
2.12.1. Получение векторной ДНК.
2.12.2.Реакция лигирования. 82
2.13. Трансформация компетентных клеток E.Coli плазмидной ДНК.
2.14. Трансфекция ретровирусных и плазмидных конструктов методом кальций-фосфатной преципитации. 83
2.15. Определение эффективности трансфекции и инфекции по флюорисценции зеленого белка.
2.16. Инфекция клеток рекомбинантными ретровирусами. 84
2.17. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
2.18. Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера. 86 2.19 Экстракция РНК и Nothern-блоттинг. £6-87 2.20. Метод субтрактивной гибридизации. 87
2.21 Выделение высокомолекулярной ДНК.
2.22 Гибридизация по Саузерну
2.23. Анализ активности хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (САТ-реакция). 89
2.24. Просчет радиоактивности в пробах.
2.25 Авторадиография.
2.26. Компьютерный анализ.
3. Результаты и их обсуждение
1. Р53 с мутацией в кодоне 273 увеличивает вероятность амплификации гена с1Мг. 92
2. Исследование трансактивационных свойств мутантов р53. 94
3. Идентификация генов, активируемых мутантными формами р.53. 98
4. Получение полноразмерных кДНК генов дУТФазы, N038 и 21Ша мыши. 101
5. Анализ экспрессии генов дУТФазы, N038, 21Ша и NAP1 в перевиваемых линиях клеток мыши и человека, содержащих различные формы белка р53. 103
6. Получение клеток 10(3), содержащих дексаметозон-индуцибельный р53-Й8175, и анализ экспрессии генов дУТФазы и NAP1 в данной системе. 106
7. Конструирование линий 10(1), МОА-041, Н1299, БС-ОУ-З экспрессирующих тетрациклин-регулируемый 53 и анализ экспрессии генов дУТФазы и 21Ша в данной системе. 108
8. Влияние экспресии мутантного р53И$175 на устойчивость клеток
10(1) к 5-фтор-уридину. 113
4. Выводы