Изучение пути фолдинга фибритина бактериофага Т4 Летаров, Андрей Викторович

Короткий опис

Летаров,АндрейВикторович.ИзучениепутифолдингафибритинабактериофагаТ4: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 1999. - 126 с.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
ВАндрейВикторовичИЗУЧЕНИЕПУТИФОЛДИНГАФИБРИТИНАБ А К Т Е Р И О Ф А Г А Т4 Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Специальность

стр. 48
стабилизации образовавшейся структуры. В настоящей работе нам удалось получить прямые данные, указывающие, что, по меньшей мере для делеционных мутантовфибритина, реализуется первый вариантпутифолдинга.ФибритинбактериофагаТ4 может быть использован в качестве матрицы для создания химерных белков с фрагментами

стр. 88
усиливая способность белков к агрегации. N.6Изучениевозможности альтернативныхфибритина. 1У.6.1путейфолдингаЗамещение фолдонафибритинаС-концевъш фраг/чентом

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Летаров, Андрей Викторович
Список сокращений.
Оглавление.
I Введение.
1.1 Актуальность проблемы.
1.2 Цель и задачи работы.
1.3 Научная новизна и практическая ценность работы.
II Обзор литературы.
II. 1 Фолдинг белка как вторая половина генетического кода.
11.2 Основные закономерности фолдинга.
II.2.1 Две гипотезы механизма сворачивания.
11.2.1.1 Гипотеза нуклеации и роста.
11.2.1.2 Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов.
11.3 Молекулярные шапероны.
11.3.
DnaK/DnaJ.
11.3.2 GroEL/GroES.
11.4 Фолдинг белка и сборка бактериофагов.
11.4.1 Бактериофаги и молекулярные шапероны.
11.4.2 Фибриллярные белки бактериофагов и их сборка.
11.4.3 Фибриллярные белки фага Т4.
11.5 Структурные особенности coiled coil.
11.5.1 Основные принципы структуры coiled coil.
11.5.2 Олигомерность coiled coil.
11.5.3 Ориентация цепей в структуре coiled coil.
11.5.4 Нарушения периодичности.
11.6 Механизмы фолдинга и олигомеризации coiled coil.
11.7 Фибритин бактериофага Т4.
III. Материалы и методы.
III. 1 Штаммы бактерий и бактериофага.
III.2. Среды для выращивания бактерий.
III.3 Выращивание бактериофагов и выделение фаговой ДНК.
111.4. Плазмиды и белковые препараты.
111.5. Конструирование рекомбинантных плазмид.
111.6. Полимеразная цепная реакция.
111.7. Приготовление компетентных клеток Е. coli и трансформация плазмидной ДНК.
111.8. Экспрессия белков и анализ на растворимость.
111.9. Электрофорез белков и иммуноблот.
III. 10. Выделение и очистка белков.
III. 1.1. Определение концентрации белка.
III.1.2. Ограниченный протеолиз.
III. 13. Спектроскопия кругового дихроизма.
III. 14 Определение нуклеотидной последовательности.
III. 15. Изучение криорефолдинга.
III. 16. Дифференциальная сканирующая калориметрия.
III. 17 Солюбилизация тел включения и рефолдинг белка in vitro.
IV Результаты исследования.
IV. 1 Исходные предпосылки.
IV.2 Неспособность последовательности coiled coil участка фибритина инициировать тримеризацию и фолдинг.
IV.2.1 Получение делеционного мутанта фибритина В, лишённого Сконцевого домена.
IV.2.2 Свойства белка NB 1.
IV.2.2.1 Экспрессия, растворимость и очистка.
IV.2.2.2 Электрофоретическая подвижность.
IV.2.2.3 Чувствительность к трипсинолизу.
IV.2.2.4 Неспособность восстанавливать ДСН-устойчивое олигомерное состояние.
TV.2.2.5 Неспособность ингибировать рефолдинг фибритина В.
IV.3 Доказательство роли С-концевого домена в инициации тримеризации и фолдинга фибритина.
IV. 3.1 Получение химерного белка W31, содержащего фолдон фибритина.■.
IV.3.2 Свойства белка W31.
IV.3.2.2 Электрофоретическая подвижность.
IV.3.2.3 Свойства олигомеров W31.
IV.3.2.4 Ингибирование ренатурации фибритина В.
IV.4 Демонстрация посттрансляционной тримеризации in vivo делеционных мутантов фибритина.
IV.4.1 Совместная экспрессия фибритинов В и Е.
IV.5 Поиск мутаций, стабилизирующих мономерный интермедиат фолдинга.
IV.5.1. Получение и скрининг библиотеки случайных мутантов фибритина В1 по пяти аминокислотным остаткам в последовательности С-концевого домена.
IV.5.1.1 Растворимость мутантных белков с нарушенным
С-концевым доменом.
IV.5.1.2. Общий фенотип мутантов фибритина с нарушенным
С-концевым доменом.
IV.5.2 Свойства мутантов фибритина с нарушенной тримеризацией и фолдингом.
IV.5.2.1 Нуклеотидные последовательности мутантов.
IV.5.2.2. Экспрессия при различных температурах.
IV.5.2.3 Получение и очистка мутантных белков.
IV.5.2.4 Способность образовывать микроагрегаты в растворе.
IV.5.2.5 Спектры кругового дихроизма мутантных белков.
IV.5.2.6 Неспособность восстанавливать ДСН-устойчивое тримерное состояние.
IV.5.2.7. Чувствительность к расщеплению трипсином.
IV.5.2.8 Дифференциальная сканирующая калориметрия
ДСК) мутантных белков.
IV.5.2.9. Неспособность мутантов с нарушенным фрлдоном ингибировать рефолдинг интактного фибритина.
IV.5.3. Свойства точечных мутантов фибритина с заменами остатка Тгр476 и делеционного мутанта С1.
IV.6 Изучение возможности альтернативных путей фолдинга фибритина.
IV.6.1 Замещение фолдона фибритина С-концевым фрагментом пг9.
IV.6.1.1 Создание химерного белка WB9C.
IV.6.1.2 Свойства химерного белка WB9C.
IV.6.2. Получение и свойства делеционного мутанта WacXN полноразмерного фибритина с удалённым С-концевым доменом.
IV.6.2.1 Создание делеционного мутанта Wae XN.
IV.6.2.2 Свойства белка Wae XN.
IV.6.3 Рефолдинг фибритина XN и свойства ренатурированного белка.
IV.6.3.1 Рефолдинг.
IV.6.3.2 Свойства ренатурированного белка Wae XN.
V Обсуждение результатов.
V. 1 Доказательство роли С-концевого домена в инициации фолдинга фибритина.
V.1.2 Способность С-концевого домена фибритина к автономной тримеризации.
IV. 2 Поспрансляционное сворачивание делеционных мутантов in vivo и существование моно мерно го интермедиата.
V.3 Свойства мутантных белков с нарушенным фолдоном.
V.4 Возможны ли альтернативные пути фолдинга фибритина ?.
V.4.1 Замещение фолдона фибритина С-концевым фрагментом белка пг9.
У.4.2 Роль 1Ч-концевого домена в фолдинге фибритина.
Выводы.