Изучение структурно-функциональной организации: β , -субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы Escherichia coli Марков, Дмитрий Александрович

Короткий опис

Марков,ДмитрийАлександрович.Изучениеструктурно-функциональнойорганизации:β, -субъединицыДНК-зависимойРНК-полимеразыEscherichiacoli: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 1999. - 150 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
И Ш Т И Т У Т МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ А К А Д Е М И И Н А У К На правах рукописиМАРКОВДмитрийАлександровичИзучениеструктурно-функциональнойорганизациир'-субъединицыДНК-зависимойРНК-полимеразыEscherichiacoli(03.00.03 - молекулярная биология) Диссертация на соискание учёной степени

стр. 6
изучениенаправлений механизмов современной реализации биологии генетической информации в клетке. Первый этап этого поцесса - синтезРНКнаДНК-матрице - осупдествляетсяДНК-зависимымиРНК-полимеразами. КлеточныеРНК-полимеразы- большие, многосубъединичные белки. КорРНК-полимеразэукариот и архебактерий

стр. 6
работы транскрипционной машины. Наиболеезависимыхизученным представителем является многосубъединичныхДНК,РНК-полимеразРНК-полимеразаEscherichiacoliфункционирующая на всех этапах транскрипционного цикла бактерии, включая связывание промотора и плавлениеДНК, инициацию синтезаРНК, процессивную элонгацию и освобождениеРНК-транскрипта на терминаторах. Каталитический корРНК-полимеразыЕ.coli...

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Марков, Дмитрий Александрович
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Введение.
1.2. Открытие цинковых пальцев.
1.3. Классификация цинковых пальцев.
1.4. Биохимические и генетические подходы к изучению функций цинковых пальцев.
1.5. Трёхмерные структуры цинковых пальцев.
1.6. Моделирование структур цинковых пальцев.
1.7. Роль цинк-связывающих лигандов в формировании третичной структуры цинковых пальцев.
1.8 Взаимодействие цинковых пальцев с ДНК.
1.9. Роль цинковых пальцев в белок-белковых взаимодействиях.
1.10. Цинк в ДНК-зависимой РНК-полимеразе Е. coli.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы.
2.2. Бактериальные среды.
2.3. Компетентные клетки и трансформация бактерий.
2.4. Ненаправленный мутагенез плазмидной ДНК гидроксиламином in vitro.
2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
2.6. Клонирование продуктов ПЦР.
2.7. Реакция транскрипции тотальной ДНК фага Т
РНКП Е. coli in vitro.
2.8. Реакция транскрипции промоторных фрагментов
ДНК РНК-полимеразой Е. coli in vitro.
2.9. Получение тройного элонгационного комплекса РНКП Е. coli, остановленного в положении + относительно старта транскрипции.
2.10. Клонирование гена гроС из термочуствительных штаммов Е. coli.
2.11. Сайт-направленный мутагенез клонированного гена гроСРИШЕ. coli.
2.12. Выделение тел включения гиперпроАудированных больших субъединиц РНКП Е. coli.
2.13. Выделение и очистка РНКП Е. coli.
2.14. Реконституция РНКП Е. coli in vitro совместной ренатурацией субъединиц.
2.15. Сборка РНКП Е. coli из независимо ренатурированных субъединиц.
2.16. Замещение структурно-связанных атомов цинка на атомы железа в РНКП Е. coli in vivo.
2.17. Аффинное мечение ß'-субъединицы РНКП в составе фермента с использованием модифицированного аналога субстрата.
2.18. Реакция гидроксил-радикального расщепления Feсодержащей РНКП Е. coli.
2.19. Иммобилизация HaNi-NTA агарозе рекомбинантной РНКП, содержащей на С-конце ß'-субъединицы шесть остатков гистидина.
2.20. Ограниченный протеолиз РНКП трипсином.
2.21. Расщепление ß'-субъединицы, радиоактивно меченой в составе РНКП, бромцианом по остаткам метионина.
Глава 3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Обнаружение мутаций устойчивости к стрептолидигину в эволюционно консервативном районе F ß'-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli.
3.1.1. In vitro мутагенез клонированного гена rpoC
Е. coli и отбор полученных мутантов.
3.1.2. Биохимический анализ устойчивости к Stl мутантной РНК-полимеразы.
3.1.3 Поиск мутаций устойчивости к Stl среди описанных ранее мутаций в гене гроС, влияющих на терминационные свойства мутантных РНКП.
3.1.4 Сравнение транскрипционных свойств мутантных РНК-полимераз, устойчивых к Stl.
3.2. Локализация мутаций в гене rpoC Е. coli, влияющих на сборку и активность РНК-полимеразы при повышении температуры.
3.3 Zn-связывающий сайт в С-концевом районе ß'субъединицы РНК-Полимеразы Е. coli участвует в сборке фермента.
3.3.1. Добавление цинка в среду супрессирует Ts-фенотип мутаций в гене гроС, влияющих на сборку РНК-полимеразы.
3.3.2.Поиск Zn-связывающего домена РНКП методом локального гидрокил-радикального футпринтинга.
3.3.3.Мутагенез С-концевого Zn-связывающего сайта.
3.3.4.Реконституция in vitro мутантных РНК-полимераз в присутствии Zn2+ и реконституция фермента дикого типа в отсутствии Zn2+ одинаково приводит к образованию сходного неактивного комплекса.
3.3.5.Только |3'-субъединица, ренатурированная в присутствии цинка, способна формировать активный фермент.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.