Мокросноп Вікторія Михайлівна Вплив етанолу на клітини Euglena gracilis за умов міксотрофного культивування

Короткий опис

Мокросноп Вікторія Михайлівна, провідний інже­нер відділу мембранології та фітохімії Інституту бота­ніки імені М. Г. Холодного: «Вплив етанолу на клітини Euglena gracilis за умов міксотрофного культивування» (03.00.12 - фізіологія рослин). Спецрада Д 26.001.14 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного Національна академія наук України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
МОКРОСНОП ВІКТОРІЯ МИХАЙЛІВНА
УДК 577.161: 57.017. 83:593.161.3
ДИСЕРТАЦІЯ
ВПЛИВ ЕТАНОЛУ НА КЛІТИНИ EUGLENA GRACILIS ЗА УМОВ
МІКСОТРОФНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ
03.00.12 – фізіологія рослин
Подається на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
_________________В. М. Мокросноп
(підпис, ініціали та прізвище здобувача)
Науковий керівник Золотарьова Олена Костянтинівна, доктор біологічних наук,
професор
Київ – 2017

ЗМІСТ
Розділ
Перелік умовних позначень…………………………… 11
Вступ……………………………………………………… 12
1. Особливостібудови та метаболізму клітин
мікроводорості Еuglena gracilis……………………….. 18
1.1. Структура хлоропластів та фотосинтетичного апарату… 19
1.1.1. Біогенез хлоропластів……………………………………. 21
1.2. Парамілон як запасний полісахарид E. gracilis………… 23
1.3. Синтез жирних кислот та восків………………………… 25
1.3.1. Ферментація воскових естерів…………………………… 26
1.4. Синтез β-каротину та α-токоферолу…………………….. 27
1.4.1. Функціональна роль β-каротину та α-токоферолу……… 30
1.5. Метаболізм етанолу в клітинах E. gracilis………………. 31
1.5.1. Вплив етанолу на метаболізм клітин E. gracilis………… 33
1.5.2. Практичне значення культивування E. gracilis за
наявності етанолу…………………………………………. 34
Висновки до розділу 1……………………………………..
Список використаних джерел…………………………….
38
39
2. Умови, матеріали та методи досліджень……………… 54
2.1. Матеріали та умови культивування E. gracilis…….……. 54
2.2. Визначення концентрації клітин………………………… 55
2.3. Визначення сухої ваги клітин……………………………. 56
2.4. Встановлення концентрації етанолу……………………. 56
2.5. Визначення концентрації хлорофілів та каротиноїдів… 56
2.6. Індукція флуоресценції хлорофілу……………………… 57
2.7. Темнове відновлення пластохінонового пулу………….. 59
2.8. Полярографічне визначення О2…………………………. 60
2.9. Визначення вмісту парамілону………………………….. 61
2.10. Визначення вмісту токоферолів та β-каротину………… 62
9
2.11. Статистична обробка результатів досліджень………….
Список використаних джерел…………………………….
63
64
3. Ріст культур Euglena gracilis в умовах міксотрофії….. 67
3.1. Дія етанолу та суміші етанолу з глутаматом натрію на
ріст культур Е. gracilis…………………………………….. 67
3.2. Динаміка вмісту етанолу у поживному середовищі……. 70
3.3. рН поживного середовища в процесі культивування
Е. gracilis………………………………...…………………. 71
Висновки до розділу 3……………………………………..
Список використаних джерел……………………………..
73
74
4. Поглинання кисню у темряві та його виділення на
світлі клітинами міксотрофних культур
Euglena gracilis……………………………………………. 75
4.1. Поглинання кисню клітинами у темряві………………… 75
4.2. Світлозалежне виділення киснюклітинами……………. 78
4.3 Рівноважна концентрація кисню у поживному
середовищі культур Е. gracilis……………………………. 81
Висновки до розділу 4……………………………………..
Список використаних джерел……………………………..
83
84
5. Показники флуоресценції хлорофілу та темнове
відновлення пластохінонового пулу у клітинах
міксотрофних культур Euglena gracilis……………….. 85
5.1. Визначення показників флуоресценції хлорофілу…….. 85
5.2. Темнове відновлення пластохінонового пулу клітин….. 86
Висновки до розділу 5…………………………………….
Список використаних джерел…………………………….
90
92
6. Динаміка накопичення фотосинтетичних пігментів
при міксотрофному культивуванні Euglena gracilis… 93
6.1. Вплив етанолу на динаміку накопичення хлорофілів… 93
6.2. Вплив суміші етанолу та глутамату натрію на динаміку 95
10
накопичення хлорофілів…………………………………..
6.3. Вплив світла різної інтенсивності на вміст хлорофілів та
каротиноїдів……………………………………………….. 96
Висновки до розділу 6…………………………………….. 102
Список використаних джерел…………………………….. 103
7. Вміст парамілону, β-каротину та токоферолів у
клітинах Euglena gracilis під час міксотрофного
культивування …………..……………………………….. 104
7.1. Динаміка накопичення парамілону……………………… 104
7.2. Концентрації β-каротину та токоферолів……………….. 108
7.3. Вміст парамілону, β-каротину та токоферолів у
культуральній рідині Е. gracilis………………………….. 112
Висновки до розділу 7……………………………………. 116
Список використаних джерел…………………………….. 118
8. Аналіз та узагальнення результатів досліджень……... 120
Список використаних джерел…………………………... 127
Висновки…………………………………………………...
Додаток
128
11
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АЛГ- алкогольдегідрогеназа
АДГ – альдегіддегідрогеназа
НАД – нікотинамідаденіндинуклеотид
ПХП – пластохіноновий пул
СЗК ІІ – світлозбиральний комплекс фотосистеми ІІ
ФС І і ФС ІІ – фотосистеми І і ІІ
ЦТК – цикл трикарбонових кислот
12
ВСТУП
Обґрунтування вибору теми дослідження. Еукаріотична мiкроводорiсть
Euglena gracilis належить до протист i здатна як до фотосинтезу, так i до
живлення за рахунок поглинання органiчних субстратiв iз середовища
iснування, що є можливим як на свiтлi, так i в темрявi [1-3]. Органiчним
джерелом енергiї та вуглецю для цього органiзму можуть бути рiзноманiтнi
сполуки, включаючи етанол, який для бiльшостi iнших мiкроорганiзмiв є
токсичним. Метаболізм етанолу у клітинах E. gracilis здійснюється за рахунок
НАД+
-залежних алкогольдегідрогеназ та високоактивних альдегіддегідрогеназ,
а також ферментів гліоксилатного циклу, ізоцитратліази та малатсинтази [4-6].
Окиснення етанолу алкоголь- та альдегіддегідрогеназами веде до генерації
енергії в клітинах та утворення ацетил-КоА. Вплив етанолу на метаболічні
процеси клітин E. gracilis проявляється у збільшенні інтенсивності дихання
клітин, інгібуванні гліколітичного розщеплення глюкози та активації
глюконеогенезу, а також накопиченні в клітинах парамілону та ліпідів [7].
Етанол як легкозасвоюване джерело вуглецю для E. gracilis специфічно інгібує
біогенез хлоропластів на світлі [8]. Світлозалежний синтез основних
компонентів фотосинтетичного апарату тилакоїдних мембран, зокрема СЗК ФС
ІІ, інгібується у клітинах E. gracilis, які культивувались гетеротрофно за
наявностіетанолу, що може бути опосередковано впливом етанолу на синтез
хлорофілів[9].
E. gracilis – один з небагатьох мікроорганізмів, здатних накопичувати такі
вітаміни-антиоксиданти, як L-аскорбінова кислота, ліпофільні β-каротин і αтокоферол, які використовуються в клінічній практиці, а також для
профілактики багатьох захворювань [10]. Підвищення вмісту α-токоферолу та
його попередника тирозину в клітинах раніше було зафіксовано при
вирощуванні мікроводорості за наявності етанолу, що може бути наслідком
появи помірного оксидативного стресу, викликаного субстратом [11, 12].
13
Ефекти етанолу на ріст і метаболізм E. gracilis вивчалися переважно при
культивуванні клітин у темряві, тоді як за міксотрофних умовклітини можуть
мати інші характеристики дихання та акумуляції цінних метаболітів порівняно з
гетеротрофними культурами. Вплив екзогенного етанолу на фотосинтетичні
процеси у культурі E. gracilis, яка має сформований фотосинтетичний апарат,
представляє особливий інтерес. Наявність етанолу як субстрату може
відображатися на динаміці накопичення фотосинтетичних пігментів,
парамілону та α-токоферолу як індикатора оксидативного стресу клітин
E. gracilis. Ефект етанолу може залежати від доступності джерела азоту у
поживному середовищі. Таким чином, дана робота присвячена встановленню
шляхів впливу етанолу як субстрату на метаболізм клітин E. gracilis, які
культивуються на світлі.
Мета і завданнядослідження. Мета даної роботи – визначення впливу
етанолу як органічного джерела вуглецю при міксотрофному культивуванні
E. gracilis на фотосинтетичну активність та вміст запасного полісахариду і
жиророзчинних антиоксидантів у клітинах культури.
Відповідно до зазначеної мети було поставлено наступні завдання:
1. Дослідити вплив етанолу та суміші етанолу з глутаматом натрію на
рістміксотрофної культури E. gracilis.
2. Визначити зміну концентрації етанолу та рН поживного середовища у
міксотрофних культурах E. gracilis в процесі культивування.
3. Дослідити вплив етанолу на поглинання кисню в процесі дихання та
його фотосинтетичне виділення на світлі у клітинах міксотрофних
культур E. gracilis.
4. З’ясувати ефект присутності етанолу у поживному середовищі культур
на окисно-відновний стан пластохінонового пулу та ефективність
фотосинтезуклітин E. gracilis.
5. Дослідити зміну накопичення фотосинтетичних пігментів клітинами
E. gracilis в процесі міксотрофного культивування.
14
6. Оцінити вплив міксотрофного культивування клітин E. gracilis за
наявності етанолу на акумуляцію жиророзчинних антиоксидантів –
токоферолів і β-каротину.
7. Дослідити зміну вмісту запасного полісахариду парамілону у клітинах
E. gracilis при міксотрофному культивуванні за наявності етанолу.
Об’єкт дослідження: метаболізм клітин мікроводоростей за умов
міксотрофного культивування.
Предмет дослідження: вплив етанолу на фотосинтетичну активність та
біохімічний склад мікроводорості E. gracilis.
Методи дослідження: біохімічні (спектрофотометричний, метод
тонкошарової хроматографії, метод газової хроматографії), біофізичні
(амперометричний, флуоресцентний метод), цитологічні (світлової мікроскопії),
статистичні методи обробки даних.
Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено, що додавання
етанолу до автотрофної культури E. gracilis за першу добу міксотрофного
культивування підвищує швидкість електронного транспорту у хлоропластах
клітин на 48% та світлозалежне виділення кисню на 37%, а отже, підвищує
ефективність фотосинтезу. Після першої доби культивування за наявності
етанолу концентрація хлорофілів у клітинах міксотрофних культур суттєво
знижувалася, що може бути наслідком інгібування наявністю органічного
субстрату ресинтезу структурних компонентів фотосистем. Відновлення
синтезу хлорофілів відбувалося після 3-ої доби культивування і продовжувалось
навіть у стаціонарній фазі росту. При культивуванні міксотрофних культур на
світлі низької інтенсивності подібних змін концентрації хлорофілів у клітинах
не спостерігається. Таким чином, було вперше показано, що культивування E.
gracilis протягом 5-15 діб за наявності етанолу сприяє накопиченню
фотосинтетичних пігментів у клітинах, включаючи β-каротин, що сприяє
збільшенню фотосинтетичного потенціалу клітин. У роботі було вперше
показано, що початкова концентрація етанолу (100 мМ) на момент входу
15
культури в стаціонарну фазу росту зменшена на 43%. Вперше встановлено
стимулюючий вплив етанолу на мітохондріальне дихання клітин міксотрофної
культури E. gracilis. Встановлено негативний редокс стан клітин, культивованих
у присутності етанолу, як наслідок накопичення в них відновних еквівалентів.
За наявності етанолу вміст токоферолів знижується порівняно з автотрофним
контролем. На першу добу культивування на світлі спостерігається максимальне
накопичення запасного полісахариду парамілону, зафіксоване у дослідженні, що
свідчить про ефективність асиміляції етанолу клітинами E. gracilis.
Практичне значення одержаних результатів. E. gracilis одночасно
продукує високі кількості білків, полісахариду, антиоксидантних вітамінів і
поліненасичених жирних кислот. В роботі визначені умови, які стимулюють
ріст і сприяють накопиченню жиророзчинних вітамінів і запасного
полісахариду парамілону в біомасі E. gracilis. Показано, що швидкість поділу
клітин культур з етанолом та глутаматом натрію в експоненційній фазі росту є
на 20 % вищою, ніж із одним етанолом. Визначено фази росту міксотрофних
культур E. gracilis, в яких було в процесі досліджень зафіксовано максимальний
вміст у клітинах парамілону та жиророзчинних антиоксидантів, тобто сполук,
які мають практичну цінність та застосовуються у медицині та ветеринарії.
Отримані дані можуть бути використаними при підборі режиму культивування
E. gracilis, адаптованого для накопичення у клітинах тієї чи іншої сполуки.
Етанол позитивно впливає на синтез та акумуляцію у клітинах
фотосинтетичних пігментів, підвищує життєздатність клітин та пластичний
потенціал в умовах освітлення, що дозволяє рекомендувати даний субстрат для
використання у тристадійній техніці вирощування E. gracilis для отримання
парамілону та токоферолів. На першій стадії культивування стимулюють
накопичення біомаси культурою, а на другій – жиророзчинних антиоксидантів,
шляхом переведення клітин в умови стресу. Остання стадія характеризується
синтезом парамілону у клітинах, стимульованим внесенням етанолу.
16
Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно провела пошук та
опрацювання зарубіжної та вітчизняної літератури, яка стосується
культивування клітин мікроводорості E. gracilis з використанням органічних
субстратів. Спільно з науковим керівником д.б.н., проф. Золотарьовою О. К.
були визначені мета та основні завдання досліджень дисертаційної роботи,
обрано об’єкт досліджень. Самостійно було налагоджено міксотрофне
культивування мікроводорості E. gracilis зі зниженою вірогідністю мікотичної
контамінації культури. Здобувач самостійно проводила підготовку та
виконувала експериментальну роботу, застосовуючи методи світлової
мікроскопії, спектрофотометрії, флуоресценції, амперометрії, тонкошарової
хроматографії, за допомогою яких визначала вплив етанолу на фізіологічний
стан та біохімічний склад клітин E. gracilis. В постановці методики визначення
темнового відновлення пластохінонового пулу клітин та обговоренні отриманих
експериментальних даних брав участь співробітник відділу мембранології та
фітохімії Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного – к.б.н., н.с. Поліщук О. О.
Апробація результатів дисертації. Результати експериментальної
роботи, узагальнення та висновки доповідались на Науково-практичній
конференції «Біологічно активні речовини: фундаментальні та прикладні
питання отримання і застосування» (Новий Світ, Крим, 2011), VIII Міжнародній
науковій конференції «Молодь та поступ біології» (Львів, 2012), Міжнародній
конференції «Фізіологія і біотехнологія мікроводоростей», присвяченій 80-
літтю проф. В. Е. Семененко (Москва, 2012), Міжнародній конференції молодих
учених «Актуальні проблеми ботаніки та екології» (Щолкіне, Крим, 2013), VI
Міжнародному конгресі з фотосинтезу (Сент-Луіс, США, 2013), Науковопрактичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання біології,
екології, медицини та фармакології» (Дніпропетровськ, 2013), Міжнародній
конференції молодих учених «Актуальні проблеми ботаніки та екології»
(Умань, 2014), ХІ Українському біохімічному конгресі (Київ, 2014), Науковій
конференції та школі молодих вчених «Фундаментальні та прикладні проблеми
17
сучасної експериментальної біології рослин» присвяченої 125-літтюІнституту
фізіології рослин ім. К. А. Тімірязева РАН (Москва, 2015), XXI Пущинських
читаннях по фотосинтезу та Всеросійській конференції «Фотосинтез і
фотобіотехнологія. Фундаментальні і прикладні аспекти» (Пущино, 2015), V
з’їзді Українського товариства фізіологів рослин «Фізіологія рослин:
досягнення та нові напрямки розвитку» (Київ, 2017).
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу,
огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів роботи та їх
обговорення, аналізу й узагальнення результатів, висновків та списку
використаних джерел, який складається з 191 найменування. Робота викладена
на 128 сторінках, ілюстрована 33 рисунками та 7 таблицями.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконувалась у відповідності з планами фундаментальних
робіт відділу мембранології та фітохімії Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного
НАН України: «Вивчення і використання генетичного потенціалу
мікроводоростей України для створення екологічно безпечних біотехнологій»
(2007-2011 р.р.; № д/р 0107U000086), «Клітинні та молекулярні механізми
адаптації рослин до несприятливих змін екологічних чинників (посуха,
затоплення) в природі та експерименті» (2012-2016 р.р.; № д/р 0112U000059),
«Особливості енергетичного обміну в рослинних клітинах за різних рівнів
вуглецевого забезпечення» (2012-2016 р.р.; № д/р 0112U002315).

Список літератури

ВИСНОВКИ
Фізіологічні характеристики (швидкість мітохондріального дихання і
фотосинтетичного виділення кисню) і біохімічний склад біомаси одноклітинної
мікроводорості Euglena gracilis залежать від наявності в середовищі
культивування екзогенних джерел вуглецю. Накопичення біомаси за
міксотрофних умов значно зростає порівняно з автотрофним контролем, так як і
вміст у клітинах запасного полісахариду парамілону та фотосинтетичних
пігментів. Концентрація токоферолів у перерахунку на клітину суттєво
підвищується при автотрофному вирощуванні. Для досягнення максимального
виходу біологічно активних продуктів рекомендовано тристадійне
культивування.
1. Додавання 100 мМ етанолу до середовища культивування E. gracilis, яка
культивується на світлі 100 мкмоль·м-2
·с-1
, в експоненційній фазі росту
стимулює швидкість поділу клітин в 2,3 рази, а внесення суміші 100 мМ
етанолу та 40 мМ глутамату натрію – в 2,7 рази.
2. Зниження вмісту етанолу у концентрації 100 мМ у поживному середовищі
E. gracilis на світлі з найбільшою швидкістю спостерігається в лаг-фазі
росту культури. Метаболізм етанолу клітинами E. gracilis призводить до
зниження рН середовища культивування, яке починається після лаг-фази,
а по досягненні стаціонарної фази росту культури встановлюється на
рівні 2,5.
3. Вміст хлорофілів в клітинах міксотрофної культури E. gracilis залежить
від інтенсивності освітлення і фази росту. На початку експоненційної
фази росту відбувається зниження вмісту хлорофілів у клітинах, а після
третьої доби культивування їх вміст зростає і досягає постійного значення
в стаціонарну фазу росту культур. Внесення глутамату натрію разом із
етанолом призводить до зниження вмісту хлорофілів у біомасі
128
мікcотрофної культури, порівняно із клітинами, що ростуть за наявності
лише етанолу.
4. Швидкість мітохондріального поглинання О2 в клітинах міксотрофних
культур E. gracilis за наявності 100 мМ етанолу або суміші 100 мМ
етанолу та 40 мМ глутамату натрію зростає в чотири рази за період лагфази росту. Внесення 100 мМ метанолу як екзогенного субстрату не
впливає на дихання клітин.
5. Фотосинтетична активність клітин міксотрофних культур E. gracilis
зростає за період лаг-фази росту, про що свідчать підвищення рівня
швидкостей лінійного транспорту електронів між фотосистемами (qP) та
світлозалежного виділення О2. Інтенсивність виділення О2 за цих умов
кількісно не компенсує поглинання О2 в процесах дихання, тому
рівноважна концентрація О2 у поживному середовищі міксотрофних
культур знижується майже вдвічі.
6. Відновний потенціал клітин міксотрофних культур зростає за період лагфази росту, що призводить до відновлення пластохінонового пулу клітин
у темряві.
7. Рівень накопичення біологічно активних речовин у біомасі E. gracilis
залежить від наявності і типу екзогенних джерел вуглецю і фази росту
культури. У стаціонарній фазі росту культури за присутності глутамату
натрію разом з етанолом ефективно накопичуються антиоксиданти – βкаротин та токофероли. Максимальна акумуляція запасного полісахариду
парамілону відбувається в лаг-фазі росту міксотрофних культур
E. gracilis, а при переході культури в експоненційну фазу вміст
парамілону стрімко знижується