Молекулярные механизмы пептидной регуляции функций поджелудочной железы при старении Тарновская, Светлана Игоревна

Короткий опис

Тарновская Светлана Игоревна. Молекулярные механизмы пептидной регуляции функций поджелудоч-ной железы при старении: диссертация ... кандидата биологических наук: 14.01.30 / Тарновская Светлана Игоревна;[Место защиты: Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН].- Санкт - Петербург, 2014.- 161 с.
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИкандидат наук Тарновская, Светлана Игоревна
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Функциональная морфология поджелудочной железы при старении
1.2. Молекулярно-генетические механизмы дифференцировки клеток поджелудочной железы
1.2.1. Факторы дифференцировки клеток поджелудочной железы
1.3. Роль факторов пролиферации и апоптоза в функционировании клеток поджелудочной железы
1.4. Применение пептидных лекарственных препаратов в лечении сахарного диабета
1.5. Влияние аминокислот на клетки поджелудочной железы
1.6. Геропротекторное действие коротких пептидов
1.6.1. Влияние коротких пептидов на функции поджелудочной железы при старении
1.7. Предполагаемый механизм действия коротких пептидов
1.8 Виды взаимодействий лекарственных препаратов и белков с молекулой дезоксирибонуклеиновой кислоты
1.8.1. Взаимодействие лекарственных препаратов с дезоксирибонуклеиновой кислотой
1.8.2. Взаимодействие белков с дезоксирибонуклеиновой кислотой
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Экспериментальные методы исследования
2.1.1. Пептидные биорегуляторы
2.1.2. Приготовление раствора пептидов для введения в культуры клеток поджелудочной железы
2.1.3. Методика органотипического культивирования клеток
2.1.4. Методика диссоциированного культивирования клеток
2.1.5. Иммуноцитохимическое исследование
2.1.6. Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений
2.1.7. Метод количественного ПЦР-анализа
2.2. Физические методы исследования взаимодействия пептида КЕО¥ с молекулой дезоксирибонуклеиновой кислоты
2.2.1. Приготовление растворов дезоксирибонуклеиновой кислоты и пептида
2.2.2. Спектральные методы исследования
2.2.3. Вискозиметрия
2.3. Теоретические методы исследования комплексов дезоксирибонуклеиновой кислоты с пептидом
2.3.1. Моделирование оптимальной конформации пептидов
2.3.2. Расчет индекса гидрофобности пептидов
2.3.3. Анализ последовательностей генов и гистонов
2.3.4. Моделирование молекул дезоксирибонуклеиновых кислот и гистонов
2.3.5. Докинг
2.4. Статистическая обработка результатов исследования
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДА КЕБ¥ НА ЭКСПРЕССИЮ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
3.1. Влияние пептида КЕО¥ на ткань поджелудочной железы у молодых и старых крыс
3.2. Исследование действия пептида КЕБ¥ на экспрессию факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы при старении
3.2.1 Исследование действия пептида КЕО¥ на экспрессию Рс1х1
3.2.2 Исследование действия пептида КЕБУ на экспрессию Р1Па
3.2.3 Исследование действия пептида КЕБ XV на экспрессию Рахб
3.2.4 Исследование действия пептида КЕЮ¥ на экспрессию Роха2
3.2.5 Исследование действия пептида КЕХ)¥ на экспрессию Ыкх2.2
3.2.6 Исследование действия пептида ЮЕХ)\^ на экспрессию Рах4
3.2.7 Исследование действия пептида КЕХ)¥ на экспрессию НохаЗ
3.2.8 Исследование действия пептида КЕ1)¥ на экспрессию Схс112
3.2.9 Исследование действия пептида КЕБ XV на экспрессию генов факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы
3.3. Экспрессия факторов пролиферации и апоптоза в клетках поджелудочной железы
3.3.1 Исследование действия пептида КЕО¥/ на экспрессию проапоптозного белка р53
3.3.2 Исследование действия пептида на экспрессию антиапоптозного белка Мс1-1
3.3.3 Исследование действия пептида КЕО¥ на экспрессию белков пролиферации Кл67 и PCNA
3.3.4. Анализ микроскопических изображений
3.4. Исследование спектральных характеристик образования комплексов дезоксирибонуклеиновой кислоты с пептидами
3.4.1. Спектральные характеристики образования комплекса дезоксирибонуклеиновой кислоты с пептидом КЕЭХУ
3.4.2. Спектральные характеристики образования комплекса дезоксирибонуклеиновой кислоты с пептидом сравнения АЕОЬ
3.5 Обсуждение результатов экспериментальных исследований
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДА КЕБУ С МОЛЕКУЛАМИ ДНК И ГИСТОНОВ
4.1 Конформационный анализ пептидов и АЕЭЬ
4.1.1 Конформационный анализ КЕХ)V/
4.1.2 Конформационный анализ АЕЭЬ
4.1.3 Сравнительный анализ конформаций КЕБУ и АЕОЬ
4.2 Моделирование взаимодействия пептидов с участками
дезоксирибонуклеиновой кислоты
4.3 Поиск сайтов связывания в промоторных областях генов для пептида К-ЕОХУ
4.4 Моделирование взаимодействия пептидов с гистонами
4.4.1. Локализация гистонов в нуклеосоме
4.4.2. Взаимодействие пептидов с коровыми гистонами Н2А
4.4.3. Взаимодействие пептидов с коровыми гистонами Н2В
4.4.4. Взаимодействие пептидов с коровыми гистонами Н3.2
4.4.5. Взаимодействие пептидов с коровыми гистонами Н4
4.5 Обсуждение результатов теоретических исследований
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список літератури

Молекулярно-генетические механизмы дифференцировки клеток поджелудочной железы
В современной клеточной биологии, медицине и геронтологии особое значение имеют исследования, связанные с выяснением роли транскрипционных факторов и факторов дифференцировки в механизмах поддержания необходимого количества высокоспециализированных клеток, способных выполнять свою функцию. Выяснение механизмов дифференцировки клеток, лежащих в основе регуляции процессов жизнедеятельности, позволяет более успешно решать вопросы диагностики, профилактики и лечения многих заболеваний. Транскрипционными факторами являются белки, контролирующие перенос информации с молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в структуру матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) путем связывания со специфическими участками ДНК [Latchman D.S., 1997; Karin M., 1990]. Транскрипционные факторы выполняют свою функцию либо в комплексе с другими белками, либо самостоятельно [Roeder R.G., 1996; Nikonov D.B., Burley S.K., 1997]. Они обеспечивают снижение или повышение константы связывания РНК-полимеразы с регуляторными последовательностями регулируемого гена [Lee J.C. et al., 2001; Gray S. et al., 2011].
Нормальное функционирование -клеток является главным условием для поддержания гомеостаза глюкозы в организме. Это может выполняться оптимальной экспрессией ключевых транскрипционных факторов дифференцировки, которые включены в процесс развития клеток поджелудочной железы. Определение механизма регуляции транскрипционных факторов и их участие в регуляции важных для -клеток генов, таких, как гена препроинсулина, может помочь разобраться с механизмом, приводящим к развитию дисфункции -клеток. В процессе созревания поджелудочной железы транскрипционные факторы дифференцировки последовательно запускают экспрессию различных генов для того, чтобы обеспечить нормальный органогенез [Manzanares M. et al., 2001; Jing S. et al., 2012]. Специфические транскрипционные факторы активируются в процессе раннего развития поджелудочной железы и дифференцировки -клеток. Они могут быть выключены после созревания -клетки, предоставляя место для других транскрипционных факторов, участвующих в регуляции зрелых -клеток. Некоторые транскрипционные факторы, Pdx1, Pax4, NeuroD1, Nkx6.1, и NKX2-2, включены как в процессы регуляции развития клеток-предшественников, так и в созревании эндокринных клеток поджелудочной железы. Для обеспечения нормального органогенеза различных типов эндокринных клеток поджелудочной железы необходима активация нескольких транскрипционных факторов. Считается, что Pdx1, Pax6, NeuroD1 и NKX2-2 являются основным транскрипционным комплексом, обогащающим клетками островки Лангерганса, и которые способствуют регулировки экспрессии генов селективных к -клеткам [Cissell M.A. et al., 2003]. Таким образом, в настоящее время определены основные гены, контролирующие развитие клеток поджелудочной железы: PDX1, PAX6, ISL1, NEUROD, NGN3, MNX1, MaFA [Sander M. et al., 1997; Polak M. et al., 2000; Madsen O.D. et al., 2007]. В ряде работ установлено, что введение одного ключевого панкреатического транскрипционного фактора Pdx1 в эмбриональные стволовые клетки и мультипотентные стромальные клетки человека приводит к их дифференцировке в инсулин-продуцирующие -клетки [Федюнина И. А., 2011; Soria B., 2000]. Знание генетических механизмов развития клеток поджелудочной железы может помочь решить проблему недостатка -клеток путем активации панкреатической дифференцировки стволовых клеток.
Pdx1 (pancreatic and duodenal homeobox 1) является ключевым транскрипционным фактором, участвующим в раннем развитии поджелудочной железы, дифференцировке -клеток и поддержании необходимого количества зрелых -клеток как у экспериментальных животных, так и у людей [Cerf M.E. et al., 2005; Campbell S.C. et al., 2002]. Во взрослых -клетках Pdx1 регулирует транскрипцию генов инсулина [Ohlsson H. et al., 1993], GLUT-2 [Waeber G. et al., 1996], глюкокиназы и Nkx 6.1 [Pedersen J.K. et al., 2005]. Белок VP16 усиливает функционирование Pdx1. Pdx1/VP16 экспрессия вместе с NeuroD1 или Ngn3 индуцирует транскрипцию гена инсулина и различных факторов, необходимых для функционирования -клеток. Ген инсулина имеет сайт связывания для Pdx1 в проксимальном промоторе [Iype T. et al., 2005; Rong A. et al., 2010]. Коактиватор p300 взаимодействует с Pdx1 и усиливает транскрипционную активность через многочисленные механизмы, включая увеличение и активацию компонентов базального транскрипционного механизма и гистон/белок активацию. Pdx1, MafA и NeuroD1/E47 действуют соответственно через сайты A1, C1 и E1, локализованные в проксимальном промоторе гена инсулина [Gerrish K. et al., 2000]. Наиболее выраженное действие на промотор гена инсулина оказывает Pdx1. Две высоко консервативных последовательности в 5 -фланкирующем регионе гена Pdx1 (PH1/area1 и PH2/area2) предоставляет -клеточную специфическую транскрипционную активность на гетерологичных промоторах [Gerrish K. et al., 2000]. Pdx1 может связываться с регионом PH1/area1 и запускать собственную транскрипцию [Longo A. et al., 2006]. Транскрипцию Pdx1 могут активировать NeuroD1, Foxa2, Hnf-1 и Hnf-3 [Gerrish K. et al., 2004; Nan G. et al., 2008]. Мутации в гене PDX1 приводят к нарушению развития и функционирования -клеток и развитию сахарного диабета как у экспериментальных животных, так и человека.
В период эмбрионального развития ген PDX1 экспрессируется в эндодермальных клетках. Под действием Pdx1 эпителиоциты дифференциируют в клетки дивертикулы поджелудочной железы и, в последствии, в эндокринные и экзокринные клетки поджелудочной железы. В развивающихся -клетках одновременно экспрессируются гены белков Pdx1, Nkx6.1. Этот процесс приводит к активации экспрессии гена MafA, необходимого для созревании -клеток. Pdx1 запускает экспрессию генов инсулина и соматостатина, одновременно репрессируя ген глюкагона [Knepel W. et al., 1990]. При старении наблюдается снижение мРНК инсулина и GLUT2 [de Barros Reis et al., 2008]. В опытах на старых крысах было показано снижение уровня мРНК инсулина и Pdx1 на 50% по сравнению с молодыми крысами [Perfetti R., et al. 2000]. Известно, что введение гюкагонподобного пептида-1 (ГПП-1) приводит к увеличению уровней мРНК инсулина и Pdx1. Такой эффект был связан с активацией экспрессии гена PDX1 пептидом ГПП-1.
В поджелудочной железе Nkx2.2 экспрессируется в инсулин-продуцирующих -клетках, глюкагон-продуцирующих -клетках и панкреатический полипептид -секретирующих РР-клетках островков Лангерганса. Экспрессия гена NKX2-2 не обнаружена в соматостатин-содержащих -клетках. В поджелудочной железе Nkx2.2 регулирует экспрессию гена NEUROD1 в гормон-продуцирующих эндокринных клетках поджелудочной железы. Белок NeuroD1 необходим для регуляции транскрипции гена инсулина [Furuta H. et al., 1998; Sussel L. et al., 1998]. Мутация гена NEUROD1 может привести к развитию сахарного диабета различных типов MODY у молодых людей, вызванного нарушением синтеза инсулина [Yamagata K. 2003]. Ген NKX2-2 является мишенью для белка Pdx1 и начинает экспрессироваться в клетках-предшественниках эндокринных клеток поджелудочной железы сразу после активации гена PDX1. В процессе дифференцировки панкреатических клеток экспрессия гена NKX2-2 сохраняется только в эндокринных -, -, и РР-клетках [Doyle M.J., Sussel L. 2007; Papizan J.B. et al., 2011]. В отсутствие гена NKX2-2 в -клетках не происходит активации гена препроинсулина и отсутствует экспрессия гена NKX6.1 (Nk6 transcription factor homolog A), что приводит к прекращению дифференцировки -клеток [Sussel L. et al., 1998]. Промотор гена NKX2-2 содержит сайты связывания для Foxa2 и Pdx1 [Pauls S. et al., 2007]. Фактор дифференцировки Nkx2.2 в свою очередь связывается с промотором гена инсулина и PAX4 [Furuta H. et al. 1998]. Ngn3 (neurogenin 3).
Влияние коротких пептидов на функции поджелудочной железы при старении
Короткий пептид KEDW был создан как миметик инсулинотропных пептидов [Хавинсон В.Х. 2005; Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2008; Балин В.Н. и соавт., 2000]. Его биологическая активность впервые была проверена на модели аллоксанового диабета у крыс. Крысам вводился аллоксан в дозе 35 мг/кг массы тела. Аллоксан по своей структуре похож на пиримидиновые основания урацил и тимин, поэтому может интеркалировать в ДНК и нарушать синтез белков, в частности инсулина. Пептид KEDW вводили в дозе 3 мкг на 3 мл NaCl в течение 44 дней, что способствовало нормализации синтеза инсулина [Khavinson V.Kh et al., 2007; Khavinson V.Kh et al., 2010]. Впервые было предположено, что вероятным механизмом стимуляции биосинтеза инсулина пептидом является его взаимодействие с большой бороздкой двойной спирали ДНК в промоторном участке гена, что может привести к конкурентному вытеснению аллоксана гидрофобной боковой группой остатка триптофана [Хавинсон В.Х., Малинин В.В. 2008]. На крысах в модели локальной патологии (стрептозотоцинового диабета), связанной с частичным некрозом -клеток поджелудочной железы и формированием инсулиновой недостаточности в качестве ускоренного экспериментального старения, исследовалось действие пептида KEDW [Хавинсон В.Х. и соавт., 2010]. В течение 10 дней крысам per os вводили раствор пептида в дозе 400 мкг/кг массы тела и исследовали уровень глюкозы в крови, цис-гидроксипролина и инсулиноподобного фактора роста. Накопление метаболита цис-гидроксипролина в плазме крови свидетельствовало о преждевременном старении организма. Введение пептида приводило к нормализации уровня глюкозы и инсулиноподобного фактора роста в крови, а также снижало количество цис-гидроксипролина. В другом эксперименте пептид нормализовал адгезивность эндотелия микрососудов брыжейки и снижал уровень глюкозы в крови у крыс при пероральном и внутримышечном введениях [Хавинсон В.Х. и соавт. 2007].
Клинические исследования показали эффективность применения пептида KEDW у лиц старших возрастных групп, страдающих сахарным диабетом 2-го типа [Коркушко О.В. и соавт., 2009; 2011]. Исследовались две группы пациентов: 30 здоровых и 33 больных сахарным диабетом 2-го типа. Под влиянием пептида KEDW у больных сахарным диабетом 2-го типа снижался уровень глюкозы в крови и индекс инсулинорезистентности. Снижение мелатонинобразующих функций эпифиза, которое происходит при старении, может способствовать развитию инсулинорезистентности у людей пожилого возраста. Помимо корригирующего влияния на нарушенные показатели углеводного обмена применение пептида KEDW увеличивало продукцию ночного мелатонина в крови, оказывал дополнительный сахароснижающий эффект у больных с высокой исходной резистентностью к инсулину и гиперинсулинемией, улучшал липидный состав сыворотки крови, функционального состояния эндотелия, и реологические свойства крови [Коркушко О.В. и соавт. 2013]. Другой пептид с последовательностью Ala-Glu-Asp-Gly-OH исследовался на лабораторных приматах. Изучалось его действие на островковый аппарат поджелудочной железы и обмен глюкозы [Хавинсон В.Х., Шутак Т.С., 2000; Гончарова Н.Д. и соавт. 2004]. Установлено, что пептид Ala-Glu-Asp-Gly-OH восстанавливал понижающуюся с возрастом толерантность к глюкозе и динамику уровня инсулина в ответ на нагрузку глюкозой приматов.
Предполагаемым механизмом действия пептида KEDW является взаимодействие с промоторным участком генов белков, экспрессию которых он увеличивает [Khavinson V. et al., 2005; Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2008; Хавинсон В.Х. и соавт., 2012]. Были проведены работы по изучению взаимодействия коротких пептидов, в том числе пептида KEDW, с одно- и двуцепочечными дезоксирибоолигонуклеотидами и комплексами ДНК -фага [Fedoreyeva L.I. et al., 2011a]. О взаимодействии пептидов с олигонуклеотидами и ДНК судили по влиянию пептидов на спектры флуоресценции меченных 5,6-карбоксифлуоресцеином дезоксирибоолигонуклеотидами, а также на спектры флуоресценции FITC-меченного пептида KEDW при добавлении ДНК -фага. Пептид KEDW практически в одинаковой степени тушил флуоресценцию одноцепочечной олиго(dA) и олиго(dT) и не влиял на флуоресценцию олиго(dC) и олиго(dGC). В опыте с флуоресцентно-меченными ДРОН выявлено небольшое связывание пептида KEDW с одно- и двуцепочечным участком FAM-GCGGCGGATCCGGCGGCGGCG. В опыте с ДНК -фага показано, что при введении ДНК -фага в раствор с FITC-меченным пептидом KEDW наблюдалось сильное тушение флуоресценции, что свидетельствует о связывание пептида с ДНК. Таким образом, пептид взаимодействовал как с короткими одно- и двутяжевыми дезоксирибоолигонуклеотидами, так и с ДНК [Fedoreeva L.I. et al., 2011a]. Установлено, что пептиды могут влиять на синтез белков и экспрессию генов [Dmitrieva V.G. et al., 2008]. Так, пептиды семакс и Pro-Glu-Pro воздействуют на экспрессию генов нейротрофинов у животных. У крыс под действием cемакса уровень мРНК генов рецепторов нейротрофинов снижался, а под действием Pro-Glu-Pro увеличивался. Применение пептидов компенсировало изменения экспрессии генов при патологии у животных [Dmitrieva V.G. et al., 2008]. Пептиды вилон (Lys-Glu), тимоген (Glurp), эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly) и кортаген (Ala-Glu-Asp-Pro) изменяли экспрессию от 194 до 266 генов у животных [A Anisimov S.V. et al., 2002; 2004].
При поиске аналогичных структур в базе данных Protein Data Bank был найден комплекс ДНК-пептид под идентификатором 2KV6 [Huang H. et al., 2010]. Пептид со структурой Lysrp-Lys-Lys ковалентно связывался боковой группой лизина с атомом азота N2 гуанина в малой бороздке дуплекса ДНК 5 -d(GCTAGCAGTCC)-3 .5 -d(GGACTCGCTAGC)-3 . Структура была получена методом ядерно-магнитного резонанса. Авторы статьи утверждали, что связывание короткого пептида H-Lysrp-Lys-Lys-OH с ДНК стабилизирует молекулу ДНК, что является защитным механизмом от мутаций в геноме. Эта работа подтверждает предположение, что короткие пептиды могут связываться с ДНК, а образование ковалентной связи между пептидом и аденином ДНК указывает на возможность пептидов эпигенетически регулировать активность генов. При исследовании связывания FITC-меченных гистонов пшеницы с короткими пептидами in vitro было обнаружено, что пептид KEDW связывается с гистонами H1.1, H1.3, и H3 [Федореева Л.И. и соавт. 2013]. Наиболее сильное тушение флуоресценции наблюдалось при взаимодействии пептида KEDW с H3 гистоном. Таким образом, представленные выше литературные данные указывают на две потенциальные мишени эпигенетического действия пептида KEDW в клетке: регуляторный участок ДНК и гистоны.