Роль амилоидной трансформации a-синуклеина в нарушении гликолиза при синуклоинопатиях Мельникова Александра Кирилловна

Короткий опис

Оглавление диссертациикандидат наук Мельникова Александра Кирилловна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. Актуальность проблемы
2. Степень разработанности темы
3. Цели и задачи
4. Объект и предмет исследования
5. Научная новизна
6. Теоретическая и практическая значимость
7. Методология исследования
8. Положения, выносимые на защиту
9. Степень достоверности данных
10. Личный вклад автора
11. Публикации по теме научно-квалификационной работы (диссертации)
12. Апробация работы
13. Структура диссертации
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. а-синуклеин и синуклеинопатии
1.1. Структура а-синуклеина
1.2. Функции а-синуклеина
1.3. Амилоидогенная трансформация а-синуклеина и ее взаимосвязь с
синуклеинопатиями
1.3.1. Классификация синуклеинопатии и роль а-синуклеина в их развитии
1.3.2. Механизм агрегации а-синуклеина
1.3.3. Токсичные формы а-синуклеина. Распространении патологии от клетки к клетке при синуклеинопатиях
1.4. Нарушения клеточного метаболизма при синуклеинопатиях
1.4.1. Нарушения митохондриального гомеостаза
1.4.2. Нарушения в метаболизме глюкозы: пентозофосфатный путь, гликолиз, цикл Кребса
2. Использование низкомолекулярных соединений для предотвращения амилоидогенной трансформации белков
2.1. Природные полифенольные соединения. Куркумин
2.2. Производные гидроксикоричных кислот
3. Соматическая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и нейродегенеративные заболевания
3.1. Структура и ферментативная активность соматической ГАФД человека
3.2. Взаимосвязь ГАФД и нейродегенеративных заболеваний. Взаимодействие а-синуклеина и ГАФД
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МАТЕРИАЛЫ
МЕТОДЫ
1.Оптимизация процесса выделения и очистки рекомбинантного а-синуклеина человека
1.1. Получение а-синуклеина с мутациями Y136Y(TAC^TAT) и A53T для экспрессии в E. coli
1.1.1. Сайт-направленный мутагенез
1.1.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле
1.1.3. Лигирование
1.1.4. Получение компетентных клеток E. coli
1.1.5. Трансформация бактериальных клеток
1.1.6. ПЦР-скрининг коллоний
1.1.7. Наращивание биомассы E. coli, содержащих плазмидную ДНК
1.1.8. Выделение плазмидной ДНК
1.2. Выделение и очистка рекомбинантного а-синуклеина человека с мутацией Y136Y(TAC^TAT) и A53T из E. Coli
1.2.1. Наработка рекомбинантного а-синуклеина в E. Coli
1.2.2. Выделение рекомбинантного а-синуклеина из E. coli
2. Выделение рекомбинантной соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека.

2.1. Наработка рекомбинантной соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека (чГАФД) в E. Coli
2.2. Выделение рекомбинантной соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека (чГАФД)
3. Получение и изучение различных форм а-синуклеина in vitro
3.1. Получение олигомеров а-синуклеина
3.2. Получение фибрилл а-синуклеина
3.3. Измерение флуоресценции тиофлавина Т
3.3.1. Измерение спектра флуоресценции тиофлавина Т
3.3.2. Измерение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т в планшете
3.3. Спектроскопия кругового дихроизма
3.4. SDS-электрофорез
3.5. Иммуноблоттинг
3.6. Нативный электрофорез в щелочной среде
3.7. Оценка цитотоксичности мономеров и олигомеров а-синуклеина
4. Инактивация ГАФД различными формами а-синуклеина
4.1. Приготовление проб
3
4.2. Измерение активности ГАФД
4.2.1. Приготовление растворов NAD+ и Г-3-Ф
5. . Получение клеток, продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантной формы A53T на основе нейробластомы SH-SY5Y
5.1. Получение конструкций, содержащих ген а-синуклеина дикого типа или с мутацией А53Т в векторах рVax1 и pcDNA3.1/Hygro(+)
5.1.1. ПЦР-амплификация гена а-синуклеина
5.1.2. Переосаждение ПЦР-продукта
5.1.3. Рестриктная реакция
5.1.4. Выделение образцов ДНК из агарозного геля
5.1.5. Лигазная реакция
5.2. Культивирование клеток нейробластомы SH-SY5Y
5.2.1. Подсчёт клеток
5.3. Получение клеток, транзиентно экспрессирующих а-синуклеин дикого типа или с мутацией A53T
5.4. Получение клеток, стабильно экспрессирующих а-синуклеин дикого типа или с мутацией A53T
5.4.1. Получение клонов SH-SY5Y со вставкой гена а-синуклеина дикого типа или мутацией A53T
5.4.2. Анализ продукции белка клетками SH-SY5Yметодом иммуноблоттинга
6. Анализ амилоидной агрегации а-синуклеина в клетках нейробластомы SH-SY5Y
6.1. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами, специфичными к а-синуклеину
6.2. Цитохимическое окрашивание тиофлавином S
7.Измерение гликолитических параметров клеток нейробластомы SH-SY5Y, продуцирующих а-синуклеин
7.1. Измерение активности ГАФД и накопления лактата в клеточных лизатах
7.1.1. Получение клеточных лизатов
7.2.2. Запуск гликолиза в клеточных лизатах
7.2.3. Измерение активности ГАФД в клеточных лизатах
7.2.4. Измерение накопления лактата в клеточных лизатах
7.2. Измерение глюкозы и лактата в культуральной среде
7.2.1. Измерение концентрации лактата
7.2.2. Измерение концентрации глюкозы
8. Ингибирование фибриллизации а-синуклеина производными гидроксикоричных кислот
8.1. Получение производных гидроксикоричных кислоты
8.2. Расчет полумаксимальной константы ингибирования фибриллизации а-синуклеина
8.3. Докинг производных гидроксикоричных кислот и фибрилл а-синуклеина
8.5. Спектроскопия кругового дихроизма
8.6. Сканирующая ион-проводящая микроскопия
4
8.7. Индукция фибриллизации мономерного а-синуклеина добавлением фибриллярных агрегатов
8.8. Измерение цитотоксичности производных гидроксикоричных кислот
9. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Оптимизация наработки и очистки рекомбинантных а-синуклеина и ГАФД человека
1.1. Получение а-синуклеина с мутациями Y136Y(TAC^TAT) и A53T для экспрессии в E.
coli
1.2. Выделение а-синуклеина дикого типа Y136Y(TAC^TAT)
1.3. Выделение рекомбинантной ГАФД человека
2. Получение и изучение различных форм а-синуклеина
2.1. Получение олигомеров а-синуклеина
2.2. Получение фибрилл а-синуклеина
3. Инактивация ГАФД различными формами а-синуклеина in vitro
4. . Получение клеток, продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму A53T на основе нейробластомы SH-SY5Y
4.1. Получение конструкций, содержащих ген а-синуклеина дикого типа или с мутацией А53Т в векторах рУах1 и pcDNA3.1/Hygro(+)
4.2. Получение стабильно продуцирующих а-синуклеин дикого типа и A53T клонов на основе нейробластомы SH-SY5Y
5. Анализ амилоидной агрегации а-синуклеина в клетках нейробластомы SH-SY5Y
5.1. Анализ амилоидной агрегации а-синуклеина в клетках нейробластомы SH-SY5Y, транзиентно продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму А53T
5.2. Анализ амилоидной агрегации а-синуклеина в клетках нейробластомы SH-SY5Y, стабильно продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму А53Т
6.Измерение гликолитических параметров клеток нейробластомы SH-SY5Y, продуцирующих а-синуклеин
6.1. Измерение гликолитических параметров клеток нейробластомы SH-SY5Y, транзиентно продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму А53Т
6.2. Измерение гликолитических параметров клеток нейробластомы SH-SY5Y, стабильно продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму А53Т
7. Ингибирование фибриллизации а-синуклеина производными гидроксикоричных кислот
7.1. Тестирование эффективности 9 производных гидроксикоричных кислот в предотвращении фибриллизации а-синуклеина
7.2. Предотвращение амилоидной агрегации а-синуклеина тремя производными гидроксикоричных кислот
ЗАКЛЮЧЕНИЕ