Селекция ЛАК клетками белка Tag7 человека, клонирование и изучение соответствующего гена Миркина, Ирина Ильинична

Короткий опис

Миркина,ИринаИльинична.СелекцияЛАКклеткамибелкаTag7человека,клонированиеиизучениесоответствующегогена: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 1999. - 146 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
/ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИГЕНАНа правах рукописи УДК 577Л+599.323.4МИРКИНАИРИНАИЛЬИНИЧНАСЕКРЕЦИЯЛАККЛЕТКАМИБЕЛКАTAG7ЧЕЛОВЕКА,КЛОНИРОВАНИЕИИЗУЧЕНИЕСООТВЕТСТВУЮЩЕГОГЕНАспециальность 03.00.03- молекулярная биология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических

стр. 4
поликлональной антисыворотки кбелкуTag7-Очистка поликлональныхTag7-cneцuфuчecкux антител-Выделение и культивирование лейкоцитов периферической крови иЛАКклетокчеловека-Культивирование трансформированных клеточных линий -Определение цитолитической активности-Изучениефрагментации ДНКклеток-мишеней -Иммуногистохимический

стр. 53
млекопитающих и, в частности, учеловека? Исследование функциональной значимости Tag? связано с идентификацией иизучениемгенаtag?человека. и Поэтомуизучениюпредставленнаягенаработа а была посвящена анализу модельнойклонированиюпотенциальной tag?человека,белкатакже ролисоответствующегос

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Миркина, Ирина Ильинична
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ-
ВВЕДЕНИЕ-
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 Основной принцип врожденного и приобретенного иммунного ответа-------------------------------------------------
2 Рецепторы, вовлеченные в неклональный иммунный ответ
2.1 Общая характеристика------------------------------------------------11
2.2 Семейство Toll/IL-IR
3 Белковые факторы, продуцируемые в процессе иммунного ответа: сигналы опасности
3.1 Прямое цитолитическое действие на чужеродный антиген-----------18
3.2 Хемоаттракция (хемотаксис)—
3.3 Стимуляция клепальных Т- и В- лимфоцитов и
клеток врожденного иммунитета------------------------------------22
4 Роль сигналов опасности в противоопухолевом иммунитете:
4.1 ЛАК клетки как in vitro модель для изучения противоопухолевого иммунитета
4.2 Причины иммунологической толерантности организма в отношении опухолей----------------------------------—-----------------------------25
4.3 Механизм повышения иммуногенности с помощью сигналов
опасности---------------------------------------------------------------28
5 Индукция программированной гибели клеток-мишеней,
пораженных чужеродным антигеном: 5. 1 Классификация механизмов клеточной гибели:
некроз и апоптоз------------------
5.2 Основные признаки апоптоза--------------------------------------------33
5.3 Основные механизмы трансдукции апоптотического сигнала:
5.3.1 Роль адапторных молекул в апоптозе---------------------------------34
5.3.2 Эффекторные молекулы: идентификация, пути активации и осуществления эффекторных функций в процессе апоптоза-----------38
5.4 Регуляция "апоптотической программы": ингибиторы и активаторы апоптоза и их значение для организма—---------------------------------43
ЗАКЛЮЧЕНИЕ-
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:
-Ферменты и реактивы------------------------------г----------------------55
-Агарозный гель-электофорез ДНК------------------------------—
-Реакция обратной транскрипции и амплификация фрагментов кДНК
tag 7-
-Плазмидные и фаговые векторы-----------------------------------
-Штаммы бактерий---------------------------------------------------------57
-Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК----------------------------57
-Выделение плазмидной ДНК-------------------------------------------------59
-Определение первичной последовательности ДНК---------------------------60
-Выделение тотальной РНК
-Выделение хромосомной ДНК и приготовление образцов
хромосомной ДНК для Саузерн-блот-гибридизационного анализа-----------61
-Выделение фаговой ДНК-
-Нозерн- и Саузерн- блот гибридизационный анализ
-Конструирование геномной человеческой библиотеки-----------------------67
-Приготовление бактериальных штаммов, определение
титра и амплификация библиотеки----------------------------------------68
-Скрининг библиотеки
-Клонирование, экспрессия и выделение рекомбинантного
интерлейкина 2--------------------------------------------------------------72
-Получение поликлональной антисыворотки к белку Tag7--------------------74
-Очистка политональных Tag7-специфических антител-
-Выделение и культивирование лейкоцитов периферической
крови и ЛАК клеток человека------------------------------------------------76
-Культивирование трансформированных клеточных линий------------------77
-Определение цитолитической активности----------------------------------78
-Изучение фрагментации ДНК клеток-мишеней-----------------------------78
-Иммуногистохимический анализ--------------------------------------------79
-Иммунофлуоресцентный анализ---------------------------------------------80
Иммунопреципитация Tag 7-подобного иммунореактивного белка из клеточных лизатов и кондиционной среды-------------------------80
-Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блот анализ----81
-Иммуноаффинная хроматография Tagl-иммунореактивного белка--------84
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ:
- Мышиный ген tag 7 имеет своего человеческого гомолога-------------------86
- Идентификация и клонирование фрагмента
кодирующей ДНК гена tag 7 человека---------------------------------------87
- Клонирование полноразмерной к ДНК человеческого tag 7--------------------90
- Идентификация геномной копии tag7 человека-----------------------------93
- Изучение геномной организации tag7 человека. Сравнительный анализ геномных копий человеческог и мышиного tag 7-----------------------------94
-Иммуногистохимический и иммунофлуоресцентный анализ экспрессии
Tag 7 в тканях и органах человека-----------------------------------------98
-Изучение экспрессии мРНК tag 7 в лейкоцитах периферической крови и
лимфокин- активированных киллерах человека-----------------------------106
-Анализ белков супернатанта ЛАК клеток с помощью Вестерн-блот
анализа с антителами к Tag7---------------------------------------------109
-Ингибирование цитолитической активности супернатанта
ЛАК клеток антителами к Tag7----------------------------------------—115
-Нуклеосомальная фрагментация ДНК клеток-мишеней, индуцированная супернатантом ЛАК клеток и ее ингибирование
антителами к Tag7-
-Хроматографическое выделение Tag7- иммунореактивного
белка на иммуно аффинном сорбенте------------------------
ВЫВОДЫ-