Шелеметьева Ольга Владимировна. Определение витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в премиксах, биологически активных добавках и пищевых продуктах

Короткий опис

Шелеметьева Ольга Владимировна. Определение витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в премиксах, биологически активных добавках и пищевых продуктах : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.02 / Шелеметьева Ольга Владимировна; [Место защиты: Том. политехн. ун-т].- Томск, 2009.- 138 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-2/719

ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
04200911933
ШЕЛЕМЕТЬЕВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ПРЕМИКСАХ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ И
ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Специальность 02.00.02-аналитическая химия
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель: доктор химических наук, Слепченко Г.Б.
Томск - 2009 
Содержание
Литературный обзор
1.1. Основные свойства витаминов
1.2. Аналитические возможности физико-химических
методов определения витаминов
1.3. Современное состояние определения витаминов
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Экспериментальная часть
2.1. Приборы, оборудование и методика выполнения
эксперимента
2.2. Растворители и реактивы
2.3. Объекты исследования
3.1. Выбор рабочих условий для определения
водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ
3.2. Изучение взаимного влияния водорастворимых
витаминов и расчет их предельно допустимых соотношений в методе ВЭЖХ
4.1. Исследование влияния pH среды при
пробоподготовке исследуемых объектов
4.2. Изучение мешающего влияния органической
матрицы при определении водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ
5
11
12
18
27
32
34
34
37
48
51
52
4.3. Оптимизации условий подготовки пробы при
з
определении витаминов методом
ВЭЖХ 55
4.4. Алгоритм пробоподготовки при определении водорастворимых витаминов методом
ВЭЖХ 61
Глава 5 Методики определения витаминов методом
ВЭЖХ 64
5.1. Методика определения водорастворимых
витаминов в премиксах, БАД и пищевых продуктах методом ВЭЖХ 64
5.2. Методика определения жирорастворимых
витаминов в премиксах, БАД и пищевых продуктах методом ВЭЖХ 71
5.3. Расчет массовых концентраций витаминов 74
5.4. Метрологическое обеспечение
хроматографического анализа 75
Обсуждение результатов 88
Выводы 92
Библиографический список использованной
литературы 94
Приложения 119
ОБОЗНАЧЕНИЯ
Биологические активные добавки Водорастворимые витамины Жирорастворимые витамины Инверсионная вольтамперометрия Спектрофотометрия
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Г азо-жидкостная хроматография
Тонкослойная хроматография
Предел обнаружения
Федеральный Реестр
Государственный стандарт
Г осударственный стандарт России
Государственная Фармакопея
Нормативный документ
Фармакопейная статья
Обращенно-фазовая хроматография
Нормально-фазовая хроматография
Обращенная фаза
Стационарная фаза
Подвижная фаза
Ультразвуковое воздействие
Г осударственный стандартный образец
Концентрация, %, мг/мл, М
Величина систематической погрешности, %
Остальные обозначения пояснены в тексте.
Введение
Актуальность. Водорастворимые и жирорастворимые витамины - незаменимые органические вещества, биологические катализаторы химических реакций, протекающих в организме человека; они активно участвуют в обмене веществ и поступают в организм человека практически полностью из внешней среды.
Для поддержания баланса витаминов в организме широкое применение нашли витаминизированные продукты и биологически активные добавки к пище (БАД). Одним из важнейших показателей потребительского качества продукции подобного рода является соответствие содержания биологически активных веществ согласно заявленной рецептуре. Для восстановления качества продуктов питания был принят документ «Основы государственной политики в области здорового питания граждан Российской Федерации на период до 2020 года», пришедший на смену «Концепции здорового питания населения России до 2005 года».
Разработка и совершенствование методов определения витаминов является актуальной задачей, от решения которой зависит качество и безопасность подобной продукции. Выбор инструментального метода анализа для определения водо- и жирорастворимых витаминов в пищевых продуктах обусловлен рядом общих соображений, например: пределами обнаружения метода в зависимости от определяемых содержаний, требованием мпогоэлементности, допускаемой погрешностью, временными затратами, стоимостью анализа. Безусловно, предпочтение отдается методам, требующим минимальной подготовки пробы к анализу при максимальной информативности. Таким требованиям максимально удовлетворяет метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Современное развитие метода ВЭЖХ расширило аналитические возможности определения витаминов в обогащенных пищевых продуктах. Необходимая подготовка пробы образца весьма проста относительно других методов, что связано прежде всего с исключительной универсальностью, высокой эффективностью разделения, благоприятными условиями анализа (низкая температура, инершый растворитель, отсутствие контакта с кислородом).
Однако, несмотря на интенсивное развитие этого метода в последние 10 лет, в литературных источниках практически отсутствуют методики определения витаминов в таких объектах, как БАД. Трудности в создании методик во многом обусловлены сложностью объектов анализа, таких как обогащенные продукты, в состав которых входят лекарственное растительное сырье (ЛРС), растительные экстракты (РЭ), различные минеральные добавки, красители и другие наполнители; низкими концентрациями витаминов в объектах анализа и высокой чувствительностью к термическому, фотоокислительному и химическому воздействиям. Поэтому разработка экспрессных методик одновременного количественного определения водо- и жирорастворимых витаминов в БАД является актуальной задачей.
Целью работы являлось исследование параметров хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В, выбор оптимальных условий их определения и разработка экспрессных методик аналитического контроля БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание жиро- и водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
• исследовать хроматографическое поведение водорастворимых витаминов при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола, провести оценку коэффициентов емкости, асимметрии и разрешения пиков витаминов; 
• установить параметры хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В;
• оптимизировать основные стадии и предложить алгоритм пробоподготовки для определения витаминов в БАД, обогащенных пищевых продуктах и премиксах;
разработать и метрологически аттестовать методики количественного химического анализа БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание витаминов
Научная новизна:
• впервые исследовано хроматографическое поведение водорастворимых витаминов при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола и установлены условия определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ;
• показана применимость универсальной квазихимической модели удерживания для оценки роли межмолекулярных взаимодействий сорбат- сорбент, модификатор-сорбент в хроматографической системе и проведен расчет параметров хроматографического разделения: коэффициентов емкости, асимметрии и разрешения пиков водорастворимых витаминов;
• проведена оценка мешающего влияния водорастворимых витаминов группы В при их совместном присутствии, рассчитаны предельные соотношения водорастворимых витаминов в пробе при заданной систематической погрешности и оценены основные составляющие органической матрицы при определении витаминов методом ВЭЖХ;
• впервые установлены и оптимизированы условия ультразвуковой обработки проб для интенсификации стадии экстракционного извлечения
пищевых продуктов и премиксов для последующего определения содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ;
• впервые разработаны методики количественного химического анализа проб БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание водо- и жирорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
Практическая значимость работы состоит в том, что:
• на основании проведенных исследований проведена метрологическая аттестация методик количественного химического анализа водорастворимых витаминов (ВРВ) и жирорастворимых витаминов (ЖРВ) для широкого тфУга объектов: премиксов, БАД и витаминизированных продуктов пиххдсвои промышленности. Методики позволяют экспрессно (в течение 45-60 ічі^нут) проводить определение 6 водорастворимых витаминов в сложной матрице БАД;
• разработанные методики: «Биологически активные добавки, пиіхх^вьіе продукты, премиксы. Хроматографический (ВЭЖХ) метод опреде-дения массовой концентрации водорастворимых витаминов Вь (никотинамид, никотиновая кислота ), В5, В6 и фолиевой КИСЛОТЧЕД» И «Биологически активные добавки, премиксы. Хроматографический (ВСЕ^ЭЗСХ) метод определения массовой концентрации жирорастворимых витамин <д>^
Е и Дз» метрологически аттестованы и внесены в государстветтдьш Федеральный реестр методик выполнения измерений, допущенный к применению в сфере государственного метрологического контроля и надх^з°Ра под номерами ФР. 1.31.2005.01917, МУ 08-47/185 и ФР. 1.31.2005.0181 О 34У 08-47/184 и используются в практике аналитических лабораторий ЭЗУУО «Эвалар» (г. Бийск), ЗАО «Алтайвитамины» (г. Бийск), «Внешторгфарма» (г. Москва) и НИИ фармакологии (г. Томск), что подтверждается соответствующими актами о внедрении.
Положения, выносимые на защиту:
1. Описание удерживания водорастворимых витаминов с позиций теории универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ.
2. Закономерности удерживания водорастворимых витаминов группы В в условиях градиентной обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ и выбор рабочих условий хроматографического определения водорастворимых витаминов.
3. Условия пробоподготовки БАД, пищевых продуктов, премиксов и алгоритм оптимизации стадии УЗ-экстрагирования при определении витаминов.
4. Методики хроматографического определения водо- и жирорастворимых витаминов.
Апробация работы.
Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на международном симпозиуме «Федеральный и региональный аспекты политики здорового питания» (Кемерово, 2002), международной
конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006), региональной научно-практической
конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, 2007), II Всероссийской конференции по аналитической химии» с международным участием (к юбилею академика Ю.А.Золотова) (Краснодар, 2007), международной выставке и научно-практической конференции «Аналитические методы измерений и приборы в пищевой промышленности» (Москва, 2007), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА- 2008» (Уфа-Абзаково, 2008), II Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж , 2008), VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 2008), IV Всероссийской конференции «Новые
достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).
Структура и объем диссертации.
Работа изложена на 138 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и содержит 27 таблиц. Диссертация состоит из введения и пяти глав, включая литературный обзор. Список цитируемой литературы содержит 180 библиографических названий работ отечественных и зарубежных авторов. Во введении обоснована актуальность проблемы, определены цели и задачи исследования. Первая глава представляет собой обзор литературы по физико¬химическим методам определения водорастворимых и жирорастворимых витаминов в различных объектах. На основании литературного обзора формируются задачи исследования. Описание используемого оборудования, растворителей, реактивов и объектов исследования приведены во второй главе. Третья глава посвящена выбору рабочих условий определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ, изучению взаимного влияния водорастворимых витаминов и расчету их предельно допустимых соотношений в методе ВЭЖХ. В четвертой главе проведены исследования по влиянию pH среды при подготовке проб, изучено влияние органической матрицы при определении водорастворимых витаминов, изложены результаты оптимизации условий подготовки проб и алгоритм пробоподготовки при определении витаминов методом ВЭЖХ. В пятой главе представлены методики определения водо- и жирорастворимых витаминов и метрологическое обеспечение хроматографического анализа. Анализ полученных экспериментальных данных приведен в обсуждении результатов. В заключении сделаны выводы. В приложении представлены таблицы обобщенных данных по определению показателей повторяемости (сходимости) и показателей внутрилабораторной прецизионности,
свидетельства о метрологической аттестации разработанных методик и акты о внедрении результатов работы.

Список літератури

Выводы
1. Исследованы условия определения водорастворимых витаминов группы В методом ВЭЖХ при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола. Рассчитаны коэффициенты емкости, асимметрии и разрешения пиков витаминов с применением универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ. Установлено, что оптимальное значение параметров удерживания витаминов наблюдается при содержании модификатора - 5 об. %.
2. Сделана сравнительная оценка коэффициентов удерживания водорастворимых витаминов, рассчитанных различными методами: по программе ACD-Lab/Log Р Version 1.0 и с применением универсальной квазихимической модели и проведено их сопоставление с литературными данными. Выбраны условия хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В: колонка Simmetry-Ci8, водно-ацетонитрильный элюент.
3. Исследовано мешающее влияние водорастворимых витаминов и проведен расчет их предельных соотношений при определении методом ВЭЖХ с систематической погрешностью не более 15 %.
4. Изучено влияние органической матрицы в модельных системах на основе белка, сахара, жира и пектина при определении водорастворимых витаминов и проведена оценка предела обнаружения витаминов Вь В2, В3, В5, Вб, В9 при совместном определении их методом ВЭЖХ. Установлено, что стандартное отклонение определяемого содержания большинства водорастворимых витаминов не превышает 20 %, а для витамина В9 - 40 %.
5. Разработан алгоритм пробоподготовки, предложена дополнительная стадия УЗ-экстрагирования и проведена ее оптимизация на примере витамина В9 в БАД, обогащенных пищевых продуктах и премиксах.
Разработаны методики количественного химического определения Вь В2, В3, В5, Вб В9, А, Е и D3 в биологически активных добавках, премиксах и пищевых продуктах. Методики метрологически аттестованы и внесены в Федеральный Реестр МВИ, что подтверждается свидетельствами об аттестации и внедрением в ряде аналитических лабораторий.