Слободяник Людмила Олександрівна РОЛЬ СІРКОВОДНЮ ТА МОНООКСИДУ АЗОТУ У РЕГУЛЯЦІЇ КРОВООБІГУ В ПЕЧІНЦІ

Короткий опис

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА На правах рукопису Слободяник Людмила Олександрівна УДК 612.35:612.14:612.15 РОЛЬ СІРКОВОДНЮ ТА МОНООКСИДУ АЗОТУ У РЕГУЛЯЦІЇ КРОВООБІГУ В ПЕЧІНЦІ 03.00.13 фізіологія людини і тварин Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Янчук Петро Іванович КИЇВ 2015 Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 2 ЗМІСТ ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ.................................................... 4 ВСТУП.......................................................................................................... 6 РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ.......................................................... 12 1.1. Регуляція печінкового кровообігу....................................................... 12 1.1.1. Структурно-функціональні особливості печінки та її судинного русла 12 1.1.2. Нервова регуляція кровообігу в печінці.................................. 16 1.1.3. Вплив гуморальних факторів на печінковий кровообіг......... 18 1.2. Участь газових трансмітерів cірководню та монооксиду азоту у регуляції печінкової гемодинаміки............................................................ 21 1.2.1. Утворення і метаболізм сірководню........................................ 26 1.2.2. Вплив сірководню на судини.................................................... 28 1.2.3. Синтез і метаболічні перетворення монооксиду азоду.......... 30 1.2.4. Судинорухові ефекти монооксиду азату................................. 32 1.3. Особливості регуляції печінкового кровообігу при портальній гіпертензії...................................................................................................... 35 1.3.1. Обмін і регуляторні ефекти сірководню та монооксиду азоту при портальній гіпертензії..... 37 РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ..................... 41 2.1. Об’єкт досліджень................................................................................. 41 2.2. Реєстрація тиску в кровоносних судинах........................................... 41 2.3.Вимірювання тканинного кровотоку в печінці щурів методом кліренсу водню з електрохімічною його генерацією................................ 42 2.4. Реєстрація кровонаповнення печінки................................................. 48 2.5. Експериментальна модель портальної гіпертензії............................. 50 2.6. Визначення вмісту нітрит-аніону в плазмі крові щурів з портальною гіпертензією............................................................. 50 Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 3 2.7. Гістологічне дослідження тканини печінки....................................... 52 2.8. Використані препарати......................................................................... 52 2.9. Статистична обробка результатів досліджень.................................... 53 РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ. 54 3.1. Участь сірководню у регуляції кровообігу в печінці щурів............. 54 3.1.1. Вплив попередника синтезу сірководню L-цистеїну на печінковий кровообіг та тиск крові в її артеріальних і ворітних судинах.. 55 3.1.2. Дія донора cірководню NaHS на гемодинаміку в печінці щурів 70 3.1.3. Вплив сірководню на кровообіг в печінці за умов портальної гіпертензії.................................................................................. 77 3.2. Участь монооксиду азоту у регуляції печінкового кровообігу..................................................................................................... 90 3.2.1. Роль NO у регуляції печінкового кровообігу............................................................................. 92 3.2.2. Ефекти L-аргініну на печінковий кровообіг в умовах блокади NO-синтаз....................................................................................... 97 3.2.3. Участь монооксиду азоту у регуляції кровообігу в печінці при портальній гіпертензії........................................................................... 104 УЗАГАЛЬНЕННЯ...................................................................................... 116 ВИСНОВКИ................................................................................................ 131 СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ........................................................................... 132 Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 4 ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ АСТ - аспартатамінотрансфераза АЛТ - аланін амінотрансфераза АТФ - аденозинтрифосфат АХ - ацетилхолін В/п - внутрішньопортально В/оч - внутрішньоочеревинно В/р - внутрішньоректально ВВ - ворітна вена ВНС - вегетативна нервова система ГМК - гладеньком’язова клітина ЕТ-1 - ендотелін-1 іNOS - інуцибельна NO-синтаза КНП - кровонаповнення печінки ЛК - локальний кровотік НА - норадреналін ПА - печінкова артерія ПГ - портальна гіпертензія рО2 - напруження кисню сNOS - конститутивна NO-синтаза САТ - системний артеріальний тиск Твв - тиск у ворітній вені цГМФ - циклічний гуанозинмонофосфат ЦНС - центральна нервова система ЦСО - цитохром-с-оксидаза NOS - NO-синтаза NO3 - - нітрат-аніон NO2 - - нітрит-аніон Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 5 NO - монооксид азоту nNOS - нейрональна NO син таза NaHS - гідросульфід натрію L-NAME - ефір N-нітро-L-аргінінметиловий iNOS - індуцибельна ізоформа синтази оксиду азоту H2S - сірководень EDHF - ендотелій-залежний гіперполяризуючий фактор CSE - цистатіонін-γ-ліаза CSD - цистеїн сульфінат декарбоксилаза cNOS - конститутивна ізоформа синтази оксиду азоту СDO - цистеїндиоксигеназа CNMT - гліцин N метилтрансфераза CBS - цистатіонін-β-синтаза МАТ - метіонінаденозилтрансфераза 3-MPST - 3-меркаптопіруват сульфуртрансфераза Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 6 ВСТУП Актуальність теми. Сірководень (Н2S) і монооксид азоту (NO) належать до групи газових трансмітерів, що мають потужну судинорозширювальну дію та широко досліджуються в останні роки. Їх унікальність полягає у здатності діяти аутокринно та паракринно, а також без зв’язування з рецепторами на поверхні клітинної мембрани і без залучення вторинних посередників проникати всередину клітини та брати участь у регуляції фізіологічних процесів на рівні клітин та органів [253]. Фізіологічні ефекти Н2S та NO пов’язані з регуляцією діяльності серцевосудинної, імунної, ендокринної, дихальної, видільної, сенсорної та нервової систем [85, 210, 113]. Також доведена їх важлива гепатопротекторна роль [71, 152]. Так, сірководень сприяє покращенню процесів регенерації в печінці, запобігає окисненню ліпідів, є потужним антиоксидантом, має антиапоптозні властивості [71, 75, 148], тоді як у високих концентраціях може спричиняти патологічні cтани [176]. Він здатний розширювати печінкову артерію, ворітну та порожнисту вени [158]. Разом з тим, його донор Na2S викликає звуження синусоїдів печінки при ендотоксемії та призводить до зростання тиску у ворітній вені [128]. NO сприяє посиленню антиоксидантних властивостей і підвищенню ферментативної активності печінки [229, 263]. В умовах блокади NOсинтази рівень NО в плазмі крові щурів знижується, кровотік в печінці зменшується, а системний артеріальний тиск підвищується, що може призвести до розвитку гіпертензії [56, 204]. Попередник синтезу NO Lаргінін посилює проходження перфузату через печінку, викликаючи розширення її судин [31]. Інші дослідники на підставі ультразвукового вимірювання товщини чaсток печінки дійшли висновку, що NO не відіграє істотної ролі у депонуванні крові залозою [54]. Також зазначено, що при застосуванні методу доплерографії дослідження кровотоку в залозі NO не справляє судинорозширювальну дію та не покращує загальний Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 7 функціональний стан печінки при ішемії реперфузії [56]. Разом з тим, за результатами інших авторів NO виявляє судинорозширювальну дію в печінці і запобігає ішемічному її ураженню [53, 104]. У високих дозах (100-200 мг/кг) L-аргінін може викликати патологічні стани печінки та інших органів шлунково-кишкового тракту, зокрема підшлункової залози [11, 172]. На противагу цьому є відомості про те, що дози від 50 до 500 мг/кг сприяють зростанню печінкового кровообігу, посилюють надходження кисню до залози та виявляють лікувальні властивості [64]. Таким чином, вищезгадані автори подають суперечливі відомості стосовно впливу NO і Н2S на різні судини печінки. Так, при дії NO описують зміни кровотоку в магістральних судинах залози (печінковій артерії та ворітній вені), котрі є судинами опору, та зміни тонусу цих судин, тоді як вплив даного трансмітера на тканинний кровотік в залозі та її ємнісні судини майже не вивчено. До того ж, суперечливими є свідчення стосовно дії одних і тих же доз попередника синтезу NO L-аргініну на печінкову гемодинаміку. А щодо впливу Н2S на судинне русло печінки, то це питання залишається взагалі майже не дослідженим. Надзвичайно актуальним є також з'ясування участі цих газових трансмітерів у регуляції печінкового кровообігу при портальній гіпертензії. Зв'язок роботи з науковими програмами, планам, темами. Дисертаційна робота виконана згідно плану науково-дослідних робіт НДІ фізіології імені академіка Петра Богача ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках науководослідної теми № 11БФ036-01 "Механізми реалізації адаптаційнокомпенсаторних реакцій організму за умов розвитку різних патологій" (2011- 2015 рр., № держреєстрації 0111U004648). Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з'ясувати роль газових трансмітерів сірководню та монооксиду азоту у регуляції печінкового кровообігу в нормі та за умов портальної гіпертензії. Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 8 Відповідно до мети дисертаційного дослідження поставлено наступні завдання: 1) вивчити вплив попередника синтезу сірководню L-цистеїну на тиск у ворітній вені, кровонаповнення печінки та тканинний кровотік в ній у щурів в дослідах in vivo; 2) з’ясувати роль цистатіонін-γ-ліази у реалізації судинорухових ефектів L-цистеїну в печінці; 3) дослідити дію донора сірководню NaHS на печінкову гемодинаміку; 4) з’ясувати роль попередника синтезу монооксиду азоту L-аргініну у регуляції депонування крові печінкою та її тканинного кровотоку; 5) дослідити участь L-цистеїну у регуляції кровообігу в печінці за умов портальної гіпертензії у щурів; 6) вивчити залучення L-аргініну до регуляції печінкового кровообігу при портальній гіпертензії. Об’єкт дослідження: кровообіг в печінці щурів. Предмет дослідження: регуляція сірководнем та монооксидом азоту печінкового кровообігу щурів. Методи дослідження: фізіологічні, біохімічні, гістологічні та методи математичної статистики. Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що сірководень бере активну участь у регуляції кровообігу в печінці, свідченням чому є розширення внутрішньопечінкових судин, зумовлене внутрішньопортальним введенням попередника синтезу Н2S L-цистеїну або його донора NaHS. На фоні дії DL-пропаргілгліцину (блокатора цистатіонін-γ-ліази) відбувається пригнічення синтезу Н2S як з ендогенних його попередників, так і з екзогенного L-цистеїну, що зумовлює звуження кровоносних судин печінки. Показано, що попередник синтезу монооксиду азоту L-аргінін викликає розширення мікроциркуляторних та ємнісних кровоносних судин Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 9 печінки, що призводить до збільшення тканинного кровотоку і об’єму депонованої в ній крові. Блокада NО-синтаз за допомогою L-NAME повністю усуває ефекти L-аргініну, принічуючи синтез NО як з нього, так і з ендогенних попередників, що циркулюють у кровоносному руслі. В результаті цього відбувається звуження внутрішньопечінкових судин і, як наслідок, зменшення тканинного кровотоку в органі та його кровонаповнення. Вперше показано, що тривале (впродовж 20 діб) внутрішньоочеревинне введення щурам з натрій-йодною моделлю портальної гіпертензії L-цистеїну або L-аргініну призводить до нормалізації тиску в судинах печінки і тканинного кровотоку в ній, при цьому спостерігається часткова регенерація тканини залози. Встановлено, що при портальній гіпертензії вміст стабільного метаболіту монооксиду азоту NO2 в судинному руслі печінки збільшується, що може бути зумовлено додатковою активацією ендотеліальної та індуцибельної форм NOS. Двадцятиденне введення L-аргініну призводить до повернення концентрації NO2 до вихідного рівня і за механізмом зворотнього зв'язку пригнічує активність еNOS і синтез NO в судинах печінки. L-цистеїн підвищує вміст цього метаболіту в плазмі крові ворітної вени портальногіпертензивних тварин, активуючи NOS. Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі експериментальні результати мають як теоретичне, так і практичне значення, оскільки дають змогу доповнити сучасні уявлення про роль газових трансмітерів сірководню та монооксиду азоту у регуляції кровообігу в печінці. Вивчення дії H2S і NO на печінкову гемодинаміку є також важливим для з’ясування механізмів виникнення та розвитку багатьох захворювань печінки та біліарної системи, зокрема портальної гіпертензії. Так, при цій патології порушується синтез і, як наслідок, фізіологічна рівновага у крові вазомоторних чинників, у тому числі й газових трансмітерів, внаслідок чого внутрішньопечінкові судини Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 10 звужуються, тиск крові у портальному руслі зростає, виникають зміни архітектоніки печінки. L-аргінін та L-цистеїн призводять до нормалізації гемодинаміки печінки та її мікроструктури. Отримані у роботі результати щодо шляхів реалізації дії L-цистеїну і L-аргініну, як попередників синтезу потужних судинорозширювальних факторів сірководню та монооксиду азоту, дають змогу рекомендувати ці амінокислоти до впровадження в клінічну практику для лікування ідіопатичної форми портальної гіпертензії. Особистий внесок здобувача. Автором особисто опрацьовано першоджерела літератури, проведено експериментальну роботу, статистичну обробку та аналіз результатів досліджень. Планування досліджень, обговорення і аналіз отриманих результатів та формулювання висновків здійснено разом з науковим керівником, доктором біологічних наук, професором П.І. Янчуком. Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та обговорювалися на Х Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ в біології» (Львів, 2014 р.), на VII Міжнародній науковій конференції «Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології» (Київ, 2014), Міжнародній науковій конференції «Механізми функціонування фізіологічних систем», приуроченій 70-літтю біологічного факультету та 230-літтю кафедри фізіології Львівського університету (Львів, 2014 р.), на VІ Міжнародній конференції молодих науковців «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 2014), конференції студентів та молодих вчених «Шевченківська весна» (Київ, 2015), ХІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ в біології» (Львів, 2015), ХІХ З’їзді Українського фізіологічного товариства, присвяченому 90-річчю від дня народження академіка П.Г. Костюка (Львів, 2015). Публікації. За результатами дисертаційного дослідження опубліковано 14 наукових праць, з яких 6 статей у вітчизняних наукових Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m Click to buy NOW! PDF-XChange Viewer www.docu-track.co m 11 фахових виданнях, рекомендованих Департаментом акредитації кадрів України, з них 1 у науково-метричній базі; 9 тез наукових конференцій і форумів. Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел з 290 найменувань. Робота викладена на 164 сторінках, ілюстрована 40 рисунками і містить 11 таблиць.

Список літератури

ВИСНОВКИ 1. Сірководень бере активну участь у регуляції кровообігу в печінці, свідченням чому є розширення внутрішньопечінкових судин, зумовлене внутрішньопортальним введенням попередника його синтезу L-цистеїну або його донора NaHS. 2. Блокада цистатіонін-γ-ліази за допомогою DL-пропаргілгліцину зумовлює пригнічення синтезу Н2S як з ендогенних його попередників, так і з екзогенного L-цистеїну, викликаючи звуження кровоносних судин печінки, внаслідок чого тиск крові в них зростає, а тканинний кровотік і об’єм депонованої в органі крові зменшуються. 3. Монооксид азоту бере дієву участь у регуляції депонування крові печінкою та мікроциркуляції в ній крові, про що свідчить збільшення кровонаповнення залози та інтенсивності тканинного кровотоку в ній при введенні попередника синтезу NO L-аргініну. 4. Блокада NО-синтаз за допомогою L-NAME повністю усуває ефекти L-аргініну, в результаті чого відбувається звуження внутрішньопечінкових судин і, як наслідок, зменшення тканинного кровотоку в органі та його кровонаповнення. 5. Тривале (впродовж 20 діб) внутрішньоочеревинне введення щурам з натрій-йодною моделлю портальної гіпертензії L-цистеїну або L-аргініну призводить до нормалізації тиску в судинах печінки і тканинного кровотоку в ній та відновлення реактивності її кровоносних судин. При цьому спостерігається часткова регенерація тканини залози. 6. В умовах портальної гіпертензії в плазмі крові ворітної вени зростає концентрація NO2. Двадцятиденне введення L-аргініну призводить до зниження концентрації NO2, тоді як L-цистеїн підвищує вміст метаболіту монооксиду азоту в крові ворітної вени.