Совершенствование лабораторной диагностики алеутской болезни норок Михеев, Юрий Васильевич

Короткий опис

Михеев, Юрий Васильевич.

Совершенствование лабораторной диагностики алеутской болезни норок : диссертация ... кандидата биологических наук : 16.00.03. - Москва, 2003. - 124 с. : ил.

Совершенствование лабораторной диагностики алеутской болезни норок Михеев, Юрий Васильевич

ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

кандидат биологических наук Михеев, Юрий Васильевич

Принятые сокращения.,

Глава I. ВВЕДЕНИЕ.

Глава II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.Алеутская болезнь норок а) возбудитель АБН. б)структура генома вируса АБН в)неструктурные белки вируса АБН г)структурные белки вируса АБН д)характеристика штаммов вируса АБН

2.Пути распространения вируса АБН

3.Клинические формы и патологоанатомические изменения при АБН.

3.1.Алеутская болезнь новорожденных щенков

3.2.Классическая форма АБН

4.Иммунитет при АБН.

5 . Профилактика АБН.

6 . Диагностика АБН.

Глава III.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.МАТЕРИАЛ Ы.

1.1.Вирусы, бактериальные штаммы, плазмиды и питательные среды.

1.2.Реактивы

1.3.Праймеры

2. МЕТОДЫ.

2.1.Выделение плазмидной ДНК щелочным методом

2.2.Обработка ДНК рестрикционным эндонуклеазами

2.3.Постановка полимеразой цепной реакции

2.4.Электрофорез в агарозном геле

2.5.Очистка ПЦР-фрагментов электрофорезом в агарозном геле.

2.б.Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

2.7.Получение рекомбинантных молекул in vitro

2.8.Приготовление компетентных клеток и трансформация их препаратами плазмидной ДНК

2.8.1.Подготовка компетентных клеток

2.8.2.Электротрансформация

2.9.Выделение суммарной клеточной ДНК из органов животных(фенольный метод)

2.10.Клонирование ПЦР-продуктов

2.11.Кинирование ПЦР-продуктов

2.12.Достройка ПЦР-продуктов

2.13.Электофорез белков в ПААГ-ДСН

2.14.Окраска кумасси

2.15.Методика постановки ПЦР-ИФА

2.15.1.Полимеразная цепная реакция

2.15.2.Подготовка полестероловых микроплашек для ПЦР-ИФА.

2.15.3.Условия постановки ПЦР-ИФА

2 .16. Постановка РИЭОФ на АБН.

2.17.Определение активности термостабильной пирофосфатазы

PPase)

2.18.Экспрессия белков

2.19.Определение растворимости белка

2.20.Методика иммуноферментного анализа

2.20.1.Сущность метода

2.20.2.Постановка реакции

2.20.2.1.Сенсибилизация планшетов

2.20.2.2.Внесение исследуемых сывороток и антивидвого коньюгата.

2 . 20 . 2 . 3 . Внесение субстрата и учет реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ЧАСТЫ. Разработка ПЦР - диагностикума для обнаружения ДНК вируса алеутской болезни норок

1.Получение ПЦР-продукта

2.Получение плазмиды Y1C (положительный контроль)

3.Получение плазмиды Y1CBK (внутренний контроль)

4.Отработка условий постановки полимеразной цепной реакции с плазмид Y1C и Y1CBK.

5.Определение минимального расчетного количества плазмиды Y1C, необходимого для детекции ПЦР-продукта в агарозном геле.

6.Потеря ДНК вируса алеутской болезни норок при выделении фенольным методом

7.Определение минимального количества плазмиды Y1CBK для проведения диагностического ПЦР

8.Апробация ПЦР с пробами клинического материала

ЧАСТЫ I. Детекция ПЦР-продуктов ДНК вируса алеутской болезни норок в ИФА формате.

1.Определение специфичности праймеров N-Aleutl и N

Aleut2.

2. Определение способности ПЦР-продуктов вируса АБН с праймеров N-Aleutl и N-Aleut2 связываться с белком

LV-GCN4.

3.Определение рабочей концентрации белка LV-GCN4 для детекции ПЦР-продуктов в плашечном ИФА - формате

4.Сравнение чувствительности ПЦР и ПЦР-ИФА при детекции ПЦР-продуктов вируса алеутской болезни норок

5.Апробация с пробами клинического материала.

ЧАСТЫII.Типирование вируса АБН выделенного в зверосовхозе «Родники» Московской области

1.Эпизоотологическое состояние зверосовхоза «Родники» Московской области по алеутской болезни норок

2.Сиквенс ПЦР-продуктов изолятов вируса алеутской болезни норок и сравнивание их со штаммом ADV-G.

3.Анализ гипервариабельного участка вирусов АБН.

ЧАСТЫУ.Создание химерного белка, содержащего детерминанту вируса алеутской болезни норок, и изучение ее физико-химических свойств.

1.Получение рекомбинантной плазмиды, содержащей ген химерного белка RpY-6.

1.1.Получение "ПЦР-продукта 530", содержащей ген пирофосфатазы.

1.2.Получение рекомбинантной плазмиды RpP-pa, содержащей ген белка пирофосфотазы.

1.3.Получение «ПЦР-продукта 302», содержащего детерминанту вируса алеутской болезни норок.

1.4.Получение рекомбинантных плазмид Y5-A1, содержащих спейсер и детерминанту вируса АБН.

1.5.Получение рекомбинантной плазмиды RpY-б, содержащей ген пирофосфотазы с присоединенной через спейсер детерминанту вируса АБН.

2.Изучение физико-химических свойств химерного белка pRY-6.

2.1.Экспрессия конструкций pRY-б в штамме M15[REP4]

E.Coli.

2.2.Определение экспрессии и растворимости химерного белка

RPY-б.

2.3.Очистка химерного белка pRY-6.

2.4.Определение специфичности детерминанты химерного белка в ИФА с пробами клинического материала.

Глава IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Глава V. ВЫВОДЫ.