Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-АТРазой Долгова, Наталия Валерьевна

Короткий опис

Долгова,НаталияВалерьевна.Выявлениебелков,взаимодействующихсNa,K-АТРазой: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04. - Москва, 2005. - 131 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет На правах рукописиДОЛГОВАНаталияВалерьевнаВЫЯВЛЕНИЕБЕЛКОВ,ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХС Na,K-ATPa3ofi 03.00.04 - Биохимия диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук научный руководитель доктор биологических

стр. 84
Na,K.АТРазы. 84 использованием антител против al-субъединицы Ыа,К-АТРазы установлено, что в наружном медуллярном слое почек крысы с Ка,К-АТРазойвзаимодействуют17белков.Выявлениебелков,взаимодействующихс Na,K-ATPa30ii, с использованием метода протеин-оверлей Как уже упоминалось в обзоре литературы,

стр. 85
есть несколькобелков,взаимодействующихс Ка,К-АТРазой. В таблице 3 перечислены белки,взаимодействующиес Ка,К-АТРазойи выявленные методом протеин-оверлей.

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Долгова, Наталия Валерьевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Ыа,К-АТРазы.
Структура Ыа,К-АТРазы.
Механизм функционирования Ыа,К-АТРазы.
Изоформы Ыа,К-АТРазы.
Синтез, топогенез и деградация Ыа,К-АТРазы.
Роль Ыа,К-АТРазы в функционировании различных клеток и тканей.
Роль Иа,К-АТРазы в поддержании ионных градиентов Ыа+ и 1С ив осуществлении связанных с этим функций.
Роль Иа,К-АТРазы в структурной организации клетки и клеточной адгезии.
Р-субъединица Ыа,К-АТРазы -молекула клеточной адгезии.
Разделительные контакты.
Регуляция активности Ыа,К-АТРазы.
Белки семейства FATD.
Регуляция активности Ыа,К-АТРазы путем фосфорилирования/дефосфорилирования.
Регуляция активности Ыа,К-АТРазы посредством изменения количества молекул фермента, расположенных в плазматической мембране.
ЭНДОГЕННЫЕ ИНГИБИТОРЫ Ыа,К-АТРазы.
Разновидности и свойства эндогенных ингибиторов Ка,К-АТРазы.
Параметры, характеризующие взаимодействие эндогенных ингибиторов Ыа,К
АТРазы с ферментом.
Белки крови, связывающие уабаин и уабаин-подобные соединения. Перенос сердечных гликозидов внутрь клетки и обратно.
Ыа,К-АТРаза - РЕЦЕПТОР НОВОГО КЛАССА ГОРМОНОВ
КАРДИОТОНИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ.
Роль Ыа,К-АТРазы в регуляции ионных потоков. Инотропный эффект кардиотонических стероидов.
Токсическое действие уабаина и других кардиотонических стероидов.
Кардиотонические стероиды как стимуляторы роста клеток. Влияние на экспрессию белков.
Влияние кардиотонических стероидов на перестройки плазматической мембраны и внутриклеточных везикул.
Влияние кардиотонических стероидов на прикрепление клеток к субстрату и межклеточную адгезию.
МЕЛИТТИН-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ И ИХ СВЯЗЬ С АТРазами Р-ТИПА.
Структура и свойства мелиттина.
Взаимодействие мелиттина с клеточными белками.
Мелиттин-подобные белки.
МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕСЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕЖБЕЛКОВЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ.
Аффинная хроматография.
Химические сшивки.
Иммунопреципитация.
Лиганд-блоттинг (протеин-оверлей).
Двугибридные системы.
Иммуноцитохимические методы.
Метод флуоресцентного резонанса.
Микрочипы.
Влияние детергентов на белки.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
МЕТОДЫ.
МАТЕРИАЛЫ.
ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ.
Получение фракции микросом из почек свиньи.
Получение фракции микросом из солевых желез уток.
Получение препарата очищенной Ыа,К-АТРазы.
Выделение а-субъединицы Ыа,К-АТРазы.
Получение поликлональных сывороток против а1|31-изоферментаЫа,К-АТРазы, а1субъединицы Ыа,К-АТРазы и мелиттина.
Очистка сыворотки от альбуминов путем осаждения белков сульфатом аммония.
Очистка антител на Ыа,К-АТРазу методом аффинной хроматографии.
Очистка антител на мелиттин методом аффинной хроматографии.
Выделение белков гомогената, взаимодействующих с антителами на мелиттин.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assays).
Точечный твердофазный иммуноферментный анализ (dot-ELISA, dot enzyme-linked immunosorbent assays).
Определение концентрации белка.
Электрофорез по методу Леммли.
Окрашивание гелей Кумасси бриллиантовым голубым G-250 (или R-250).
Окрашивание гелей серебром.
Анализ результатов электрофореза.
Иммуноблоттинг.
Иммунопреципитация Ыа,К-АТРазы.
Авторадиография.
Метод протеин-оверлей.
Измерение активности Ыа,К-АТРазы.
Измерение ингибирования Ыа,К-АТРазы мелиттином.
Оценка степени олигомеризации Ыа,К-АТРазы в присутствии мелиттина.
Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Ыа,К-АТРазы солевых желез утки и почек кролика.
Измерение флуоресценции ФИТЦ-меченных препаратов №,К-АТРазы из солевых желез утки и почек кролика.
Подготовка образцов для определения N-концевой последовательности белков по методу Эдмана.
Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа трипсинолизных фрагментов.
Компьютерный анализ последовательностей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Получение и характеристика поликлональных антител на Ыа,К-АТРазу и мелиттин .70 Выявление белков, взаимодействующих с Ыа,К-АТРазой, с использованием метода иммунопреципитации.
Подбор условий для проведения иммунопреципитации.
Иммунопреципитация Na.K-АТРозы в комплексе со взаимодействующими с ней белками.
Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-ATPa3oñ, с использованием метода протеин-оверлей.
Влияние уабаина на белки, преципитирующие совместно с Na,K-ATPa3oñ.
Выявление белков, взаимодействующих с Na,K-ATPa3oñ и фосфорилируемых эндогенными протеинкиназами.
Влияние мелиттина на ферментативную активность и олигомерное состояние Na,K
АТРазы.
Исследование взаимодействия Ыа,К-АТРазы с мелиттин-подобными белками.
Выделение мелиттин-подобных белков.
Взаимодействие мелиттин-подобных белков с Na.K-АТРазой.
Идентификация мелиттин-подобного белка 67 кДа.