ЛАПАРОСКОПІЧНА АПЕНДЕКТОМІЯ З ВИКОРИСТАННЯМ МЕТОДУ ЕЛЕКТРОЗВАРЮВАННЯ БІОЛОГІЧНИХ ТКАНИН

Краткое содержание

Матеріали та методи дослідження

В основі даної роботи лежать експериментальні та клінічні дослідження щодо вивчення можливості формування кукси червоподібного відростка з використанням методу електрозварювання м’яких біологічних тканин. В роботі використовувався електрозварювальний комплекс ЕК-300М1. 

Об’єктом експериментального дослідження були кролики. Робота була виконана згідно з „Правилами проведення робіт з використанням експериментальних тварин” та норм, викладених в законодавчих актах, що стосуються питань про жорстоке поводження з тваринами, а саме: статтею 89 Кодексу України про адміністративне правопорушення, статтею 299 Кримінального Кодексу України, статтею 58 Закону України „Про тваринний світ” від 03.03.1993 р. Комітетом з біоетики ВНМУ ім. М. І. Пирогова встановлено, що проведені дослідження не суперечать загальноприйнятим біоетичним нормам і виконані із дотриманням відповідних міжнародних положень стосовно проведення експериментальних досліджень (протокол № 9 від 7.05.2008).

В експериментальній частині роботи були задіяні 44 безпородних статевозрілих кролика вагою від 1,5 до 3,6 кг віком до 1,5 року. Експериментальна частина роботи включала гістологічне дослідження тканин кукси червоподібного відростка в післяопераційному періоді (І група – 32 тварини), а також дослідження апоптозу та некрозу інтактних тканин кукси червоподібного відростка та після апендектомії методом електрозварювання м’яких біологічних тканин (ІІ група – 12 тварин).

Тварини І групи виводились із експерименту на 3, 7, 14 та 30 післяопераційну добу. Матеріал для гістологічного дослідження відбирався шляхом розрізання на паралельні пластини завтовшки до 0,3 см через усі шари кукси відростка, а також по ходу вісі  кукси органа в зоні післяопераційного рубця у напрямку перпендикулярному до нього. Після чого матеріал фіксували протягом доби у 10% водному розчині нейтрального формаліну, об’єм якого у 10-20 разів перевищував об’єм вміщеного матеріалу. Вирізку останнього проводили після фіксації. У кожному випадку отримували 4-6 шматочків завтовшки 2-3 мм та площею до 1 см² із зони рубця на всю його товщину. Отриманий матеріал зневоднювали у спиртах висхідної концентрації та заливали  парафіном за звичайною методикою.

З метою морфологічного вивчення експериментального матеріалу, всі мікротомні зрізи завтовшки 4-5 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином для гістологічного дослідження, а також проводили визначення сполучнотканинних компонентів за гістохімічним методом Ван Гізон. Позитивною реакцією вважалося темно-коричневе або чорне забарвлення ядер, червоне забарвлення колагенових волокон, жовте забарвлення цитоплазми, особливо гладких та поперечносмугастих м’язів, кератину та еритроцитів.

Зрізи досліджувалися під мікроскопом фірми "OLYMPUS" при збільшенні у 100 та 400 разів.

У 3 тварин ІІ групи інтраопераційно забирались інтактні тканини червоподібного відростка, у решти – 9 тварин тканини кукси червоподібного відростка на 3, 7 та 14 післяопераційну добу. Забраний матеріал одразу занурювались в глютаральдегід, в якому і доставлялись в лабораторію. Дослідження виконувалось на цитофлуорометрі. Суспензія клітин готувалась з шматочків тканин кукси апендикса кроликів об’ємом 1-2 мм³, які розділяли на 4 частинки в фосфатно-сольовому буфері з pH=7,4, після чого їх подрібнювали в пристрої для гомогенізації-дезагрегації Medimachine (DakoCytomation) з 1,5 мл ФСБ 3 хвилини. Отриману суспензію клітин фільтрували через фільтр Filcоns 50 мкм і відмивали в 1,5 мл ФСБ шляхом центрифугування при 6000 обертах за хвилину на протязі 7 хвилин. Після видалення супернатанта і додавання до осаду ФСБ проводили інкубацію отриманої суспензії клітин Annexin V-FITC (1 мкл) та Propedium Iodide (2,5 мкл) відповідно до протоколу-інструкції використання «APOPTEST tm - FITC» (DAKO). Цитофлуорометрію проводили на лазерному проточному цитофлуорометрі (аргон 488 нм) «PAS» (Partec) з наступним аналізом за допомогою програмного забезпечення для аналізу великих масивів даних FloMax. Враховували дані отримані по прямому (FSC) та боковому (SSC) світлорозсіюванню, а також по флюорисценції клітин на першому (FL1) та другому (FL2) фотопримножувачах. Компенсація накладання флюорисценції здійснювалась засобами програмного забезпечення. Після отримання гістограм для відокремлення від фонових шумів, уламків клітин та інших мікрочастинок формували зону інтересу – гейт R1, який і підлягав безпосередньому аналізу. На гістограмах FL1/FL2 отримували чотири варіанта експресії маркерів: Q1 (експресія Propedium Iodide) – некроз, Q2 (експресія Propedium Iodide та Annexin V-FITC – подвійне фарбування) – некроз-пізній апоптоз, Q3 (без експресії), Q4 (експресія Annexin V-FITC ) – апоптоз.

З отриманих даних видно, що на ранній стадії апоптозу цілісність клітинної мембрани зберігається, однак відбувається перебудова її фосфоліпідних компонентів і на поверхні клітини з’являється фосфатидилсерин. Annexin V-FITC здатний з’єднуватися з фосфатидилсерином у присутності кальцію. Одночасне фарбування анексином V-FITC та йодидом пропидія дозволяє відділити клітини, які загинули від клітин, що тільки ступили на шлях апоптозу.

Клінічна частина роботи складалась з комплексного обстеження та лікування 135 пацієнтів з гострим апендицитом за період з 2004 р. по 2008 р. із застосуванням традиційних лапароскопічних способів апендектомії та удосконаленого лапароскопічного лігатурного способу апендектомії із використанням технології електрозварювання біологічних тканин.