МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ МЕХАНІЗМІВ ЦИРКАДІАННИХ РИТМІВ У ЩУРІВ

Краткое содержание

Матеріал, методи та моделі досліджень. Дослідження проведені на 342 статевозрілих нелінійних самцях білих щурів масою 200-230 г. Вибір статі тварин зумовлений більшою вразливістю нейроендокринної регуляції стрес-реактивності у самців (Ткачук С.С., 2000). Адаптивні системи самок динамічніші, надійніші і мають більшу резервну потужність, а, отже, саме у самців легше виявити нейрохімічні, ендокринні та морфологічні кореляти зрушень, викликаних впливом стресу. До початку експерименту тварин утримували в твариннику при сталій температурі, вологості повітря та вільному доступі до води й їжі. Усі експерименти проведені в літньо-осінній період, оскільки за літературними джерелами, це є період стабільної сезонної активності кори надниркових залоз (Клочкова Г.М. и соавт., 1990).

Експериментальні щури поділені на 9 серій досліджень. Кожна з останніх у свою чергу, складалася з двох груп. Тварини серії: №1 – (інтактні) перебували в умовах стандартного світлового режиму. Люмінесцентні лампи вмикали з 08.00 до 20.00 год, освітленість приміщення на рівні тварин становила 500 лк впродовж 7-ми діб; №2 – (контроль) знаходилися за тих же умов експерименту, як і щури серії №1, проте щоденно о 19.00 год внутрішньоочеревинно отримували ін'єкцію 1,0 мл розчинника (0,9% розчин етанолу на фізіологічному розчині); №3 –знаходилися в умовах експерименту, як і щури серії №1, щоденно о 19.00 год внутрішньоочеревинно уводили мелатонін (Sigma, США, ступінь очищення – 99,5%) у дозі 0,5 мг/кг, у 1,0 мл розчинника (0,9% розчин етанолу на фізіологічному розчині); №4 – перебували при постійному освітленні люмінесцентними лампами (моделювання гіпофункції ШЗ) протягом 7-ми діб; №5 – знаходилися в умовах експерименту, як і щури серії №4. Їм щоденно о 19.00 год внутрішньоочеревинно уводили мелатонін (Sigma, США, ступінь очищення – 99,5%) у дозі 0,5 мг/кг, у 1,0 мл розчинника (0,9% розчин етанолу на фізіологічному розчині); №6 – знаходилися в умовах експерименту, як і щури серії №4, які щоденно о 19.00 год підшкірно отримували ін'єкцію епіталону (Санкт-Петербурзький Інститут біорегуляції і геронтології ПЗО РАМН, Росія) у дозі 0,5 мкг/кг, у 0,5 мл фізіологічного розчину; №7 – перебували в умовах стандартного світлового режиму, їм проводили електролітичне зруйнування СХЯ гіпоталамуса; №8 – перебували в умовах стандартного світлового режиму, їм виконували псевдооперацію електролітичного зруйнування СХЯ гіпоталамуса; №9 – знаходилася в умовах постійної темряви – (моделювання гіперфункції ШЗ) впродовж 7-ми діб. Експерименти в серії №8 та в нічний період доби в серіях №1, 2, 3 проводили при слабкому (2 лк) червоному світлі, оскільки воно практично не впливає на біосинтез мелатоніну ШЗ.

При виконанні досліджень дотримувалися Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовують в експериментах та інших наукових цілях (1986), Директиви ЄЕС №609 (1986) та наказу МОЗ України №281 від 01.11.2000 р. „Про заходи щодо подальшого вдосконалення організаційних норм роботи з використанням експериментальних тварин”.

Після закінчення 7-денного експерименту наступного дня о 14.00 і о 02.00 год здійснювали виведення тварин з експерименту шляхом одномоментної декапітації під етаміналовим наркозом (40,0 мг/кг внутрішньоочеревинно).

Концентрацію мелатоніна в сироватці крові визначали імуноферментним методом з використанням тест-системи Direct Saliva Melatonin Elisa фірми Bugelmann (Швейцарія).

З метою виявлення морфофункціональних відмінностей досліджуваних структур та враховуючи циклічність продукції мелатоніну забір біоматеріалу здійснювали з 12-годинним інтервалом (о 14.00 і о 02.00 год).

Для комп’ютерної морфометрії отримували цифрові копії зображень досліджуваних структур з використанням мікроскопа ЛЮМАМ-Р8 (об’єктив 40^х – для цитометричних досліджень, окуляр 10^х – для гістологічних досліджень, окуляр 10^х для всіх досліджень) та цифрової камери Olympus C740UZ. Потім цифрові копії зображення аналізували за допомогою ліцензійної версії комп’ютерної програми "ВидеоТест – Размер 5.0" (ООО Видеотест, Россия) – проводили комп’ютерну мікроденситометрію із застосуванням показників, які вказані в результатах дослідження.

Для електронно-мікроскопічних досліджень шматки завтовшки 2-3 мм з ділянки локалізації супрахіазматичних ядер гіпоталамуса, гіпокампа, шишкоподібну та надниркові залози поміщали в 2,5 % розчин глютаральдегіду з активною реакцією середовища 7,3-7,4 на фосфатному буфері Міллонга. Подальшу обробку і дослідження матеріалу проводили за загальноприйнятою методикою (Dykstra M.J., 1992). Вивчення і фотографування препаратів здійснювали за допомогою електронних мікроскопів ЕМВ-100 ЛМ та ЕМ 125 К.

Для ідентифікації c-Fos у гістологічних зрізах гіпоталамуса застосовували непрямий імунофлуоресцентний метод. Як первинні антитіла використовували кролячі антитіла (IGG) до cFos (Sigma-Aldrich, США). В якості вторинних антитіл слугували козячий гаммаглобулін проти глобулінів кролика, кон’югований з флуоресцеїнізотіоціонатом (FITC) (Sigma-Aldrich, США). Ідентифікацію c-Fos у нейронах гіпоталамуса і кількісний аналіз його вмісту проводили на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) в ультрафіолетовому спектрі.

Топографічну приналежність імунопозитивних нейронів окремим структурам гіпоталамуса картували відповідно до стереотаксичного атласу мозку щура (Paxinos G.D. Watson C.C., 1985). Приналежність ідентифікованих нейронів окремим субядрам паравентрикулярного ядра (ПВЯ) здійснювали на підставі топографічної і функціональної класифікації, що наведена в роботах Armstrong W.E. et al. (1980), Swanson L.W., Kupers H.G. (1980), Swanson L.W., Sawchenko P.E. (1983), Гоуфманом Е.И. (1985, 1990). З огляду на те, що медіальне дрібноклітинне субядро ПВЯ синтезує кортикотропін-рилізинг фактор (КРФ), а латеральне великоклітинне субядро містить вазопресин-синтезувальні нейрони і обидва залучені в нейроендокринну відповідь при різноманітних стресових реакціях організму, це визначило їх вибір для з’ясування реакції нейроендокринної системи при порушенні світлового режиму.

Морфометричний і денситометричний аналіз нейронів гіпоталамуса і кількісний аналіз вмісту в них РНК проводили на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) у видимому спектрі: інтерактивно визначалися межі тіла нейрона, його ядра і ядерця, а потім автоматично обчислювали площу перерізу виділених об'єктів, концентрацію і вміст у них РНК.

На підставі отриманих показників обчислювалася концентрація РНК у виділених структурах нейронів Кi (умовних одиниць оптичної щільності – од.опт. щільності): Кi = |lg(D_i /D₀)|, і вміст РНК у виділених структурах нейронів Сi (одиниць оптичної щільності – од.опт. щільності): С_i = S_{i ֹ} |lg(D_i /D₀)|, де S_i ‑ площа структури нейрона (мкм²), а D_i і D₀ - показники оптичної щільності виділених структур нейронів і міжклітинної речовини («фону» препарату), відповідно.

З метою виконання

Тваринам 7-ої серії під етаміналовим наркозом (40,0 мг/кг внутрішньоочеревинно) здійснювали двобічну електрокоагуляцію супрахіазматичних ядер переднього гіпоталамуса. Щурів скальпували і проводили трепанацію черепа. Сталеві електроди (d=0,2 мм) уводили в головний мозок тварин за стереотаксичними координатами (Paxinos G., 1983): АР=-1,0, L=±0,2, Н=9,4. Електрокоагуляцію здійснювали анодним струмом (1 мА) впродовж 20 с. Зруйнування супрахіазматичних ядер при електрокоагуляції верифікували на зрізах мозку, які зафарбовували крезил-віолетом.

У 8-ій серії щурам застосовували "псевдооперацію" для виключення можливого впливу оперативного втручання на інтерпретацію результатів: електроди уводили в головний мозок за указаними стереотаксичними координатами, однак при цьому не подавали електричного струму.

При статистичній обробці даних морфометрії надниркових залоз вираховували середню арифметичну та її похибку, використовуючи критерій Хана-Шапіро-Уілкі. Вірогідність різниці між групами дослідження визначали за допомогою двостороннього непарного критерію Стьюдента. Результати вважали вірогідними при р≤0,05.

Коефіцієнт кореляції визначали за методом (О. І. Мерков, Л. Є. Поляков, 1974), де rху незалежно від знаку приймали за величин від 0 до 0,29 – як малу; 0,30 - 0,69 – як середню; 0,70 - 1,0 – як сильну кореляцію. Для виявлення вірогідності відмінностей результатів у дослідних і контрольних групах тварин визначали коефіцієнт Стьюдента (t), вірогідність відмінності вибірок (р) і довірчий інтервал середньої за таблицями розподілу Стьюдента. Вірогідними вважали значення, для яких p<0,05.

При імуноцитохімічному дослідженні комп’ютерну мікроденситометрію проводили за допомогою ліцензійної копії комп’ютерної програми "ВидеоТест – Размер 5.0" (ООО Видеотест, Россия). Враховуючи необхідність виконання множинних статистичних порівнянь середніх величин у статистичних вибірках, для визначення відмінностей між сукупностями використаний критерій Ньюмена-Кейлса. Розбіжність у варіюванні індивідуальних величин вимірюваного показника оцінювали за допомогою двох відповідних цьому завданню статистичних методів – критерію Фішера та критерію Левене (Hardle W. et al., 2007).