Матеріал і методи дослідження. Матеріалом для даного дослідження були серця двох об’єктів: ембріонів курей та щурів. Усього було досліджено 700 об’єктів: 350 ембріонів курки (з них 50 – контрольна група, 150 – після дії гіпоксії, 150 – після дії гіпертермії); 350 ембріонів щурів (з них 50 – контрольна група, 150 – після дії гіпоксії, 150 – після дії гіпертермії). Комісією з біоетики Дніпропетровської державної медичної академії (протокол № 7 від 22.03.05 р.) встановлено, що проведені наукові дослідження зародків експериментальних тварин відповідають етичним вимогам згідно наказу МОЗ України № 231 від 01.11.2000 року. Одержання чітко датованих термінів розвитку зародку курки і щура, можливість стандартизації етапів розвитку, а також простота у впливі тератогенних факторів є перевагою у виборі саме цього матеріалу для дослідження.
Визначивши за даними наукової літератури та експериментально ключові терміни для формування серця ембріона курки та щура, що передують основним етапам кардіогенезу, зазначили їх як можливі термінаційні періоди дії тератогенів на серце. Нами було складено порівняльну таблицю основних етапів кардіогенезу ембріонів курки і щура та для впливу обирались моменти, що передують утворенню делямінаційної пластинки, міжшлуночкової перегородки, міжпередсердної перегородки, розподілу конотрункусу на аорту та легеневий стовбур, утворенню клапанного апарату. Таким чином, найбільшу увагу ми приділяли термінам раннього кардіогенезу як у дослідженнях з ембріонами курки, так і з ембріонами щура.
Для визначення часу найбільшого впливу гіпоксії та гіпертермії на кардіогенез проводили попереднє дослідження шляхом моделювання гіпоксії та гіпертермії ембріонів у три різні періоди розвитку ембріону. Відповідно поставленої задачі спочатку формувались три експериментальні групи у кожному виді тварин. Перший експеримент впливу фізичними чиниками проводили на стадії розвитку, що відповідає початку формування серцевої трубки (у ембріонів курки – 1-ша доба інкубації, у ембріонів щура – 8-ма доба ембріогенезу), другий експеримент по впливу проводили в період ембріогенезу, що передає септації серця (у ембріонів курки – 3-тя доба інкубації, у ембріонів щура –9-та доба ембріогенезу). Третій експеримент по впливу проводився в стадії розвитку, яка відповідає закінченню септації серця кожного виду дослідних тварин (у ембріонів курки – 6-та доба інкубації, у ембріонів щура –12-та доба ембріогенезу).
Результати показали, що 1-й вплив (перша експериментальна група) гіпертермією призводив до загальної загибелі ембріонів незалежно від виду тварини, бо на цей період розвитку ембріон являє собою нестабільну систему і вплив високих температур призводить до незворотних процесів та руйнує організм. В тій же групі дослідних тварин вплив гіпоксією не мав наслідків, бо потреба ембріона в кисні на цей період розвитку незначна.
Аналіз результатів другої експериментальної групи показав, що вплив саме в цей період призводив до часткової загибелі ембріонів та формування численних вад як зовнішнього розвитку цілого ембріону, так і вад серця. Вплив на загальний розвиток в 3-й експериментальній групі теж викликав масову загибель ембріонів. Тому в подальшому нами розглядались лише результати впливу на 2-гу групу ембріонів.
У роботі використано 4 основні моделі формування вад розвитку серця. Вплив тератогенними чинниками проводили по-різному у різних видів тварин: у ембріонів курей вплив гіпоксією відбувався під час інкубації протягом 6-10 годин у закритій герметично камері – перша модель. Вплив гіпертермією проводився під час інкубації впродовж 3-х годин підвищенням загальної температури в інкубаторі до 45 градусів Цельсія – друга модель. Інкубацію проводили в лабораторних умовах за загальноприйнятими методиками (Астауров Б. Л., 1975).
Для вивчення порушень у формуванні серця вплив гіпертермією на ембріони щурів проводився опосередковано через материнську гіпертермію. Підвищення температури самки викликали шляхом однократного внутрішньоочеревинного ведення пірогеналу в дозі 3,0мг/кг – третя модель експерименту. У всіх тварин контролювали підвищення температури тіла наступного дня за допомогою електротермометра фірми "Mіcrolіfe" (Швейцарія). Встановлено, що через 24 години після внутрішньоочеревинного введення щурам-самицям пірогеналу температура підвищувалася від 36,6±0,15оС до 38,9±0,11 оС і втримувалася на даному рівні від 18 до 26 годин. У нашому дослідженні усі самки вижили. Вплив гіпоксією на ембріонів щура проводився згідно методики Н.Ф. Іваницької (Иваницкая Н.Ф., 1976) та методичних рекомендацій Міністерства охорони здоров’я України (2003 р.) підшкірним введенням нітрату натрію (50 мг/кг) одноразово – четверта експериментальна модель. Тобто в наших дослідженнях ми формували гемічну гіпоксію самиці щура та ембріонів.
Для морфологічної оцінки формування зовнішніх вад ембріогенезу і вад серця у зародків на ранньому ембріональному розвитку після дії тератогенів при макроскопічному дослідженні визначали: 1) кут згинання ембріону 2) відповідність діагностичних ознак терміну інкубації; 3) ступінь аномальних процесів розвитку та кардіогенезу (кили, ектопія серця).
Кут згинання вимірювався між двома умовними лініями, що проводились на голові та тулубі. Головна лінія проводилась паралельно тім’яній частині голови по верхньому краю ока, тулубова лінія проводилась паралельно спині на рівні бруньок обох кінцівок. Перетин цих ліній і складав кут згинання. У нормі кут згинання ембріону на стадіях розвитку, що відповідають 4-7 добі інкубації у курей та 9-10 добі ембріогенезу у щурів, складав менше , голова ембріону при цьому торкалась обов’язково хвостового відділу ембріону. Якщо кут згинання був більше 50о, а голова не торкалась хвоста, це розцінювалось як порушення розвитку.
На більш пізніх етапах ембріогенезу використовувались наступні загальноприйняті діагностичні ознаки відповідності стадії розвитку: розвиток ока та повік, формування пальців на нозі у обох видів експериментальних тварин, формування крила, дзьоба, поява пір’євих сосочків (у ембріонів курей) та формування вібрис та складок шкіри (у ембріонів щура).
Відповідно до мети і задач дослідження був використаний адекватний комплекс методів гістологічного, імуногістохімічного, морфометричного та біометричного аналізу. Всі методи можна представити як комплекс морфологічних та гістологічних методик.
Анатомічні – інкубація, препарування, моделювання вад розвитку ембріону і порушень кардіогенезу для макроскопічного дослідження ембріона та дослідження зовнішньої будови як самих зародків так і відпрепарованих сердець. Яйця курей породи білий леггорн інкубували при 38 0 Цельсія та за відносної вологості 80%. Стандартизацію здійснювали за допомогою стандартних таблиць нормального розвитку за Hamburger et Hamilton (НН). Макроскопічне дослідження проводилось для встановлення стадії розвитку, формування можливих зовнішніх вад розвитку на щойно вилучених зародках, після фіксації рідиною Буена або формаліну;
Гістологічні – виготовлення серійних гістотопографічних зрізів у взаємно трьох перпендикулярних площинах для аналізу просторового розміщення структур серця в нормі та для порівняння з порушеннями розвитку, для аналізу стану розвитку камер та перегородок серця, вад розвитку з використанням світлової мікроскопії. Гістотопографічні зрізи проводилися через шийно-грудний відділ або грудну клітину цілого ембріона на ранніх зародках як курей, так і щурів. Даний метод дозволяв порівнювати відхилення в топографії структур серця, великих судин (аорта, легеневий стовбур), клапанного апарату.
Для вивчення тонких структур, таких як кардіоміоцити, мезенхімні клітини, ендотелій, епітеліально-мезенхімні трансформації, кардіогель та проведення кількісного морфологічного аналізу використовували напівтонкі зрізи. Для виготовлення таких зрізів об’єкти заливали в епон-аралдіт.
Імуногістохімічні – для оцінки перебігу кардіогенезу в нормі та змін основних гістогенетичних процесів (проліферація, клітинна загибель, зростання клітин, васкулогенез) та їх співвідношень. Використання імуногістохімічних маркерів та систем візуалізації у зв’язку з їх високою чутливістю та інформативністю дозволяє на клітинному та тканинному рівнях кількісно оцінювати процеси клітинної проліферації, диференціювання, клітинної загибелі. Ми проводили аналіз даних як після впливу гіпертермією так і гіпоксією, що дало можливість співставили результати для визначення терміну найбільшого впливу та порушень ходу основних напрямків гістогенетичних процесів. В роботі використовували наступні маркери:
- HSP – 70 – маркер захисного білкового компоненту у тканинах серця;
- CD34 - цитоспецифічний маркер ендотелію. Використання саме цього маркеру дало можливість визначити початок та напрямок перших етапів утворення судин серця;
- α-sma - маркер гладенької м’язової тканини, використання якого дало можливість не тільки визначити основні етапи васкулогенезу, але й дозволило відстежити диференціювання первинних судин серця, що розвивається у процесі кардіогенезу та зміни, які відбуваються після впливу гіпоксії та гіпертермії;
- bcl-2 - маркер апоптозу (запрограмована загибель клітин у відповідь на зовнішні або внутрішні сигнали). Ми досліджували клітинну загибель ембріонального серця щура на ранніх етапах кардіогенезу та порушення цих процесів після впливу гіпоксії та гіпертермії;
- ядерний маркер Кі67 – маркер проліферації, він дозволяє позначити всі клітини, що знаходяться на різних стадіях мітозу.
Морфометричні – для кількісної оцінки окремих структур серця. При проведенні кількісного морфологічного дослідження керувалися загальними принципами морфо метричного та стереологічного аналізу, викладеними Автанділовим Г.Г. (1990), Кірьякуловим Г.С. зі співав. (1990). При дослідженнях розвитку серця проводилася морфометрія на поперечних та повздовжніх серійних гістотопографічних зрізах за допомогою окуляр-мікрометра МОВ 1-16. При вимірюванні товщини м’язової та мезенхімної частин стулок передсердно-шлуночкових клапанів оцінювали максимальне значення цих параметрів напроти передньої та задньої атріовентрикулярних ендокардіальних подушок (ЕП). Товщину міжпередсердної перегородки (МПП) визначали у ділянці верхівки серця (апікальна частина), середній та базальній частинах. Довжину конусно-стовбурового відділу (КСВ), довжину подушок атріовентрикулярного каналу (АВК) та та товщину ендокардіального гребеня КСВ встановлювали за кількістю зрізів, що пройшли через КСВ, помноженою на товщину зрізів. Діаметр аорти та легеневого стовбуру вимірювався у їхніх найбільш широких ділянках. стереологічні – для визначення питомого об’єму субклітинних структур;
Біометричну обробку кількісних даних за кожним вивченим параметром проводили з попереднім визначенням необхідного об’єму вибірки і графічним аналізом статистичного розподілення величин.
Морфометричні дані зазнавали статистичної обробки, для обчислення яких використовували стандартні формули (Лакин Г.Ф., 1990). Визначення достовірності відмінностей між вибірками проводили з урахуванням критерію Стьюдента, або за допомогою непараметричних критеріїв (Ван-дер-Вардена, Уілкоксона). У ході проведення біометричного аналізу отриманих результатів розрахунки виконували за допомогою ІВМ РС «Pentium» при використанні відповідних прикладних програм (№ продукту 00045-139-426-974).
Результати дослідження та їх аналіз. Прояв впливу фізичних факторів як тератогенів на хід ембріогенезу визначався в першу чергу на підвищенні смертності ембріонів. Результати дослідження показали, що найбільша ембріональна смертність в експериментальній групі ембріонів курки (вплив тератогенними чинниками на 3-тю добу) після впливу гіпертермією доводилася на 5-6-ту добу і досягала 11,5%, потім процес загибелі стабілізувався і до 15-ї добі вже залишався незначним, а до кінця інкубації знижувався, хоча кількість виживших ембріонів залишалася вже невеликою. А після впливу гіпоксією найвища смертність припадала на 8-12 добу, тобто визначалась часова післядія впливу цього фізичного фактора на розвиток ембріону. В контрольній же групі смертність спочатку інкубації не спостерігалася, а починаючи з 10-ї доби, спостерігалися поодинокі випадки, найбільша частка загиблих курячих ембріонів зустрічалася наприкінці інкубації.
Другим показником впливу тератогену на хід загального розвитку є вагові показники ембріону. Дослідження вологої ваги ембріонів курей та щурів в порівнянні з контрольною групою та в експерименті продемонстрували, що вплив зазначених фізичних факторів призводить до стабільного відставання маси, незалежно від чинника та виду піддослідних тварин (рис.1). Порівняння цілих ембріонів після впливу гіпертермією та гіпоксією з ембріонами контрольної групи обох видів тварин показало виражене відставання в розвитку на 2-3 стадії від норми, причому це відставання більш явне було у віддаленій післядії.
В нормі на ранніх етапах розвитку хвіст ембріону завжди торкається мозкових пухирів, а сам ембріон не тільки зігнутий (флексія ембріону), але й скручений за повздовжньою віссю (торсія ембріону). В експерименті ми спостерігали порушення утворення головного або тулубового вигину, а також порушення скручування головного, тулубового й хвостового відділів та явне відставання в закладці й рості бруньок кінцівок (рис.2). На ранніх стадіях інкубації після впливу фізичними факторами (гіпоксія, гіпертермія) визначалось явне зменшення кута згинання та повна відсутність скручування при інших зовнішніх ідентичних показниках розвитку ембріона в цілому (таких як маса, розмір, рівень розвитку ока та бруньок кінцівок). Такі прояви аномального ембріогенезу зустрічались в наших дослідженнях в обох видах експериментальних тварин незалежно від чинника. | 
