ОСОБЛИВОСТІ РОЗСЕЛЕННЯ І ДИФЕРЕНЦІЮВАННЯ ГЕМОПОЕТИЧНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН РІЗНОГО СТУПЕНЯ ЗРІЛОСТІ ТА ЇХ ВПЛИВ НА ФУНКЦІЮ ІМУННОЇ СИСТЕМИ У МИШЕЙ РІЗНОГО ВІКУ

Краткое содержание

Матеріали та методи дослідження. Для встановлення ролі ГСК в процесах регенерації імунної системи у мишей різного віку було використано модель радіаційного опромінення в летальній дозі. Проте, дані, отримані на такій моделі, не дозволяють в повній мірі оцінити весь комплекс впливів трансплантованих клітин на організм в умовах його нормального стану. Тому також було проведено трансплантацію ГСК різного ступеня зрілості неопроміненим тваринам, що дозволило оцінити вплив стовбурових клітин на функцію імунної системи в експерименті, наближеному до можливих умов застосування ГСК в регенеративній медицині. Крім того, трансплантація ГСК різного ступеня зрілості старим інтактним тваринам дозволяє оцінити потенційні ювенілізуючі ефекти на імунологічні показники в старому організмі.

Для оцінки здатності гемопоетичних стовбурових клітин до міграції та можливої трансдиференціації було використано модель ішемічного ураження гіпокампа шляхом 20-хвилинної оклюзії обох сонних артерій за методикою
H. Nishimura (2000), яка виконувалась спільно з співробітниками відділу цитології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Роботу виконано на 312 мишах лінії СВА/Ca (самці та самки віком 3 та 20 місяців, масою 22-28 г) з розплідника Державної установи “Інститут геронтології АМН України”; а також на 53 мишах лінії FVB “дикого типу” і 29 трансгенних по гену GFP мишах лінії FVB-Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J (самці та самки віком 3 місяці, масою 25-30 г), люб’язно наданих Європейською молекулярно-біологічною лабораторією (м. Монтеротондо, Італія).

Всі роботи з експериментальними тваринами проводились з дотриманням Закону України “Про захист тварин від жорстокого поводження” (від
21.02.2006 р.), “Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою” (Страсбург, 1986 р.), а також принципів біоетики та норм біологічної безпеки, що засвідчено висновком комісії з біоетики Державної установи “Інститут геронтології АМН України”. Всі методи досліджень виконували згідно стандартних операційних процедур, розроблених та адаптованих в лабораторії патофізіології та імунології Державної установи “Інститут геронтології АМН України” на основі рекомендованих загальноприйнятих протоколів
(Стефанов О. В., 2001; Klug C., 2002). Нумерацію та ідентифікацію мишей в довготривалих експериментах проводили за розробленою нами методикою.

Донорами клітин для трансплантації виступали миші ліній СВА/Ca та FVB-Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J. Донорами ГСК кісткового мозку були тварини віком 3 місяці, донорами ГСК фетальної печінки – плоди мишей 13,5 дня гестаційного періоду. Самцям трансплантували ГСК кісткового мозку від самців, самкам – від самок. Для збільшення числа ембріонів проводили стимуляцію суперовуляції самок мишей за допомогою комбінації препаратів фолікулостимулюючого гормону та хоріонічного гонадотропіну за розробленою нами методикою.

Враховуючи дані літератури про певну стадійність проліферативної активності різних класів прогеніторних та стовбурових клітин при їх перенесенні в сингенний організм (Tokuda N. et al., 2000), та імуносупресивні ефекти мезенхімальних клітин кісткового мозку (Welniak L. et al., 2007), тварин брали для дослідження через 3, 4 та 12 тижнів після трансплантації ГСК. Отримані результати порівнювали з результатами в контрольних групах, до яких входили інтактні тварини відповідного віку.

Реципієнтів ГСК опромінювали за 3 год. до трансплантації у підтвердженій летальній дозі 9,0 Гр для старих та 9,6 Гр – для молодих тварин, з потужністю дози 0,85-1,0 Гр/хв. за допомогою рентгенологічного апарата РУМ-17 за методикою T. Randall (1998).

Фракцію мононуклеарних клітин кісткового мозку та фетальної печінки виділяли шляхом центрифугування протягом 15 хв. при 1500 об./хв. на градієнті щільності Ficol-Paque (Sigma, питома густина 1,077 г/см³) за методом C. Klug та M. Fero (2002), що забезпечує 10-кратне збільшення кількості ГСК.

Трансплантацію клітин (1∙10⁷ виділених ядровмісних клітин кісткового мозку, або 0,8∙10⁷ виділених ядровмісних клітин фетальної печінки, що відповідає 2∙10⁴ відсортованих Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺ клітин) проводили в хвостову вену мишам в об’ємі 100 мкл середовища RPMI-1640 за допомогою розробленого нами пристрою. Опроміненим тваринам групи контролю летальної дози вводили лише 100 мкл поживного середовища RPMI-1640. Мишам лінії FVB “дикого” типу через 24 години після моделювання ішемії головного мозку трансплантували 2∙10⁵ клітин фетальної печінки ембріонів 12,5 дня розвитку від трансгенних GFP-мишей.

У піддослідних тварин визначали масу тіла, тимуса та селезінки, кількість ядровмісних клітин кісткового мозку, тимуса, селезінки та перитонеального ексудату, кількість антитілоутворюючих клітин селезінки методом реакції локального гемолізу в гелі за Ерне, титр гемолізинів та гемаглютинінів в крові, поглинальну активність перитонеальних макрофагів.

Здатність клітин кісткового мозку утворювати in vitro колонії гранулоцитарно-макрофагального ряду та колонії стромальних клітин-попередників фібробластів оцінювали в напіврідких агарових та моношарових культурах кісткового мозку. Відповідно на 9-ту та 12-ту добу культивування підраховували кількість колоній, що складались не менше як з 50 клітин, та перераховували на загальну кількість ядровмісних клітин кісткового мозку стегнових кісток (Friedenstein A. et al., 1974).

Проліферативну активність спленоцитів визначали в реакції бласттрансформації лімфоцитів під впливом Т-клітинних (фітогемаглютинін) та В-клітинних (ліпополісахарид) мітогенів.

Субпопуляції Lin^-, Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺, Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺flt⁺CD150^-,
Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺flt^-CD150⁺ та Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺flt^-CD150^- ГСК кісткового мозку та фетальної печінки визначали методом проточної цитометрії за допомогою моноклональних антитіл, кон’югованих з флуорохромами (Becton Dickinson, США) в робочій концентрації 0,5 мкг на 10⁶ клітин за рекомендаціями фірми-виробника. Субпопуляції CD3⁺, CD4^-8^- (подвійні негативні – double negative, DN), CD4⁺8⁺ (подвійні позитивні – double positive, DP), CD4⁺8^- і CD4^-8⁺ (одинарні позитивні – single positive, SP) тимоцитів та CD4⁺8^-, CD4^-8⁺, CD4⁺8⁺ Т-лімфоцитів в кістковому мозку та селезінці визначали методом проточної цитометрії за допомогою моноклональних антитіл, кон’югованих з флуорохромами (Becton Dickinson, США). В якості ізотип-контролю використовували IgG_2b-каппа щура. Відсоток загиблих клітин визначали за рівнем проникнення в клітини з пошкодженою мембраною
7-аміноактиноміцину D. Сортування популяції клітин Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺ проводили в асептичних умовах в поліпропіленові пробірки об’ємом 15 мл, що містили 3 мл поживного середовища RPMI-1640 та 20% сироватки ембріонів корів при підтриманні температури 15⁰С. Фенотипування та сортування клітин проводили на лазерному проточному цитофлуориметрі-сортері BD FACSAria (Becton Dickinson, США) на базі Державної установи “Інститут генетичної та регенеративної медицини АМН України” за допомогою програми
FACS Diva 6.1, аналізуючи одночасно 2 параметри світлорозсіювання та 5 параметрів флуоресценції. Для налаштування компенсації перекриття спектрів емісії флуорохромів при багатопараметричному аналізі використовували контрольні зразки клітин без внесення антитіл (unstained control), зразки з кожним з антитіл окремо (single stained control) та зразки з комбінацією кількох антитіл без одного (fluorescence minus one control).

Трансплантовані клітини від трансгенних GFP-мишей виявляли за допомогою імуногістохімічного методу, люмінесцентної та лазерної скануючої мікроскопії.

При плануванні дизайну експериментів використовувалась схема рандомізованих блоків. При статистичній обробці даних розраховували значення середніх арифметичних величин (М), їх середньоквадратичне відхилення (δ) і похибку середньої (m). Для визначення вірогідних відмінностей між середніми величинами використовували критерії Стьюдента (t) та Вілкоксона-Манна-Уітні (U); для оцінки розподілу чисельностей тварин, які вижили в експериментальних групах – метод Пірсона в чотирьохпольному квадраті. Відмінності вважались достовірними при р<0,05.

Результати дослідження і їх обговорення. Експерименти було розпочато з оцінки відновлювального потенціалу ГСК в умовах пошкодження імунної системи на моделі летального опромінення.

У мишей гемопоетичні стовбурові клітини, які не експресують групу маркерів лінійності (Lin^-, CD3, CD11b, CD45R/220, Ly6C/G, TER-119), експресують антиген стовбурових клітин (Sca-1⁺) та рецептор фактора росту стовбурових клітин (c-kit⁺), виділено в окрему групу LSK-клітин (Chena J. et al., 2008). Популяція цих клітин відповідальна за заміщення прогеніторних клітин при їх втраті та швидке відтворення диференційованих клітин імунної системи.

При фенотипуванні ГСК кісткового мозку для трансплантації за маркерами LSK-клітин та їх субпопуляцій було встановлено, що LSK-клітини становили біля 0,18% від усіх виділених ядровмісних клітин. Субпопуляції короткоживучих ГСК (short-term, ST-HSC) з лімфогенним потенціалом фенотипу Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺flt⁺CD150^-, та з мієлогенним потенціалом
Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺flt^-CD150^- становили 0,05% та 0,1% відповідно. В матеріалі з фетальної печінки LSK-клітини становили 0,22%, а їх субпопуляції
Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺flt⁺CD150^- і Lin^-Sca-1⁺c-kit⁺flt^-CD150^- – 0,08% і 0,11% відповідно.

Через 3 тижні після трансплантації в кістковому мозку опромінених реципієнтів ГСК фетальної печінки кількість ядровмісних клітин була більшою не лише порівняно з реципієнтами ГСК кісткового мозку, а й з тваринами контрольної групи, що особливо виражено у старих тварин (р<0,05).