Патогенез, діагностика та профілактика отруєння тварин чорнокоренем лікарським

Краткое содержание

Дисертаційна робота виконана у лабораторіях кафедр фармакології та токсикології і патологічної анатомії Національного аграрного університету з листопада 1996 по листопад 2004 р. Вивченню підлягали токсичні властивості чорнокореня лікарського, який збирали у Тульчинському і Вінницькому районах Вінницької та Тетіївському районі Київської області у травні – червні 1996 – 1997 рр. та 2001 – 2002 рр. У дослідах використовували трав’яне борошно, сіно, настій та настойку з надземних частин чорнокореня лікарського другого року вегетації. Для виготовлення настою рослинну сировину заливали водою у співвідношенні 1:10, витримували на водяній бані 15 хвилин і фільтрували через 45 хвилин. Настойку чорнокореня виготовляли за загальноприйнятою методикою шляхом настоювання трави та насіння на 70^º-му етиловому спирті у співвідношенні 1:10 протягом 7 діб.

В досліді були використані молодняк великої рогатої худоби, коні, лабораторні тварини (миші та щурі). Матеріалом для лабораторних досліджень були проби крові, сечі, патматеріал від загиблих коней, телят, мишей та щурів, борошно з сухої трави, сіно, настої та настойки з надземної частини чорнокореня лікарського другого року вегетації.

Біохімічні дослідження крові бичків та хворих коней включали визначення: вмісту загального білка у сироватці крові – за біуретовою реакцією (Антонов Б.І., 1991); у безбілковому фільтраті крові – концентрації сечовини з використанням диметилгліоксиму (Петрунь Н.М., 1970); глюкози – з антроновим реактивом (Бабаскін П.М., 1976); піровиноградної кислоти – за допомогою 2,4 динітрофеніл-гідразину (Бабаскін П.М., 1976).

Лейкограму крові виводили на підставі підрахунку 100 клітин у зафарбованих мазках за Романовським-Гімзою. Підрахунок формених елементів крові хворих коней (еритроцитів, лейкоцитів) проводили пробірковим методом у камері з сіткою Горяєва (Меньшиков В.В., 1987). Гемоглобін визначали колориметричним методом (Меньшиков В.В., 1987), гематокритну величину – мікрометодом у модифікації Й.Тодорова (1979). На основі одержаних результатів розраховували вміст гемоглобіну в одному еритроциті (ВГЕ) і середній об’єм еритроцита (СОЕ).

У сечі хворих коней за допомогою тест-наборів ”Combina” 9 SG (вир. Німеччина) визначали відносну густину, величину pН, наявність і вміст білка, гемоглобіну, нітритів, уробіліногену, білірубіну, кетонових тіл та глюкози, кількість еритроцитів.

Для патолого–гістологічного дослідження матеріал відбирали у вимушено забитих і загиблих телят, коней, мишей та щурів. Гістологічні дослідження проводили у зафарбованих гематоксиліном Караці і еозином гістозрізах з блоків, залитих у парафін (Потоцький М.К., 2001). Структурні зміни в органах фіксували на фотоплівку за допомогою фотонасадки МФН – 10.

Якісне визначення алкалоїдів у чорнокорені лікарському проводили за методикою, основаною на вилученні алкалоїдів розчином лимонної кислоти, очищенні фільтруванням, перерозподілі екстрагентів у неполярний органічний розчинник і визначенні їх тонкошаровою хроматографією (Малінін О.О., Куцан О.Т., 2003). ЛД₅₀ визначали за методом найменших квадратів (Прозоровський В.Б., 1962).

Для виконання поставлених завдань обрали наступні напрями роботи. Для встановлення динаміки гострого перебігу циноглосотоксикозу на першому етапі роботи проведено біопробу на телятах. У дослід включали 9 бичків симентальської породи віком 5–6 місяців, клінічно здорових і вільних від інвазій. Молодняк за принципом аналогів розподілили на три групи: дві дослідних і контрольну. Згодовували з дертю та мелясою тваринам першої дослідної групи трав’яне борошно чорнокореня у кількості 1040 г на голову, другої – висушене з осені листя чорнокореня у кількості 2560 г на голову. Тваринам контрольної групи згодовували дерть з мелясою.

Проби крові відбирали з яремної вени вранці до годівлі перед проведенням досліджень та через 24, 48, 72 і 96 годин від початку досліду. На 5-й день від початку згодовування чорнокореня лікарського проводили контрольний забій тварин дослідних і контрольної груп. Для гістологічних досліджень відбирали шматочки внутрішніх органів (печінки, селезінки, серця, легень, нирок).

На другому етапі в умовах виробництва вивчався циноглосоафлатоксикоз коней на Деркульському кінному заводі № 63 Луганської області, де у січні 1997 р. захворіли племінні коні, з яких протягом 10-ти місяців вибуло 197 (68% поголів’я). Встановлено, що причиною захворювання було згодовування впродовж зимівлі сіна еспарцету, на 30% засміченого переважно чорнокоренем лікарським, і соломи, що містила близько 11,3 мг/кг афлатоксину В₁. Захворювання виявлено у конематок, одно- і дворічного молодняка та спортивних коней. У березні 1997 року від хворих коней відбирали проби крові, у травні 1997 р. – проби крові і сечі та матеріал для гістологічних досліджень.

На третьому етапі токсичність чорнокореня лікарського вивчали на лабораторних тваринах.

У першій серії дослідів визначали параметри гострої токсичності чорнокореня лікарського на білих мишах (100 голів) в залежності від форми уведення (настій і настойка) і кількості спиртової настойки з трави, що дало можливість встановити абсолютно смертельну та середню смертельну дози. Спостерігали за тваринами протягом 14 діб.

Визначення абсолютно смертельної дози (ЛД₁₀₀) настойки чорнокореня лікарського проводили на клінічно здорових білих мишах масою 20 – 22 г. У дослід підбирали дві групи тварин за принципом аналогів. Виготовлену настойку випарювали на водяній бані до співвідношення 20:1 та розводили перед уведенням дистильованою водою 1:1.

Мишам дослідних груп настій та настойку уводили одноразово у шлунок за допомогою шприца і голки з спеціальним наконечником. Контрольним тваринам уводили відповідно дистильовану воду і випарений (20:1) 70^º - ний етиловий спирт. Кількості 0,5, 0,75 та 1 мл уводили методом дрібного застосування з інтервалом 1,5 години.

Мишам першої дослідної групи (10 голів) увели настій чорнокореня (виготовлений перед уведенням) у кількості 1 мл, що відповідає 0,1 г сухої надземної частини рослини другого року вегетації, тваринам контрольної групи (10 голів) – 1 мл дистильованої води.

З тварин другої дослідної групи було сформовано чотири підгрупи по 10 голів у кожній, яким уведено різні кількості настойки чорнокореня лікарського, випареної – 20:1, мл на мишу, що відповідає кількості сухої надземної частини рослини другого року вегетації: підгрупі першій – 0,25 (25 г); другій – 0,5 (50 г); третій – 0,75 (75 г); четвертій – 1,0 (100 г). Мишам чотирьох контрольних підгруп (по 10 голів у кожній) уведено випарений 20:1 70^º-ний етиловий, спирт розведений дистильованою водою 1:1, у таких же кількостях, як і настойки. Отримані показники використовували для визначення ЛД₅₀

У другій серії дослідів на щурах (120 голів) вивчали ступінь токсичності чорнокореня лікарського за хронічного отруєння при пероральному та підшкірному уведенні спиртової настойки (1:10). Щурів масою 100 – 120 г було розподілено на дві групи за принципом аналогів. Тваринам першої дослідної групи уводили настойку чорнокореня (випарену 20:1) та розведену 1:1 дистильованою водою підшкірно, другої – всередину протягом 10 діб. З щурів першої дослідної групи було сформовано чотири підгрупи по 10 голів у кожній, яким уводили настойку чорнокореня підшкірно у ділянці черевної стінки (мл на голову), що відповідає кількості сухої надземної частини рослини другого року вегетації: першій – 0,5 (50 г); другій – 1,0 (100 г); третій – 1,5 (150 г); четвертій – 2,0 (200 г).

З щурів другої дослідної групи сформовано чотири підгрупи по 10 голів у кожній, яким настойку чорнокореня уводили у шлунок (мл на голову), що відповідає кількості сухої надземної частини рослини другого року вегетації: першій – 0,5 (50 г); другій – 1,0 (100 г); третій – 1,5 (150 г); четвертій – 2,0 (200 г). Щурам першої і другої контрольних підгруп уводили всередину 2 мл 70^º-го етилового спирту, випареного 20:1 та розведеного 1:1 дистильованою водою, другої – 2 мл дистильованої води. Вели спостереження за клінічним станом тварин. Матеріал від загиблих щурів (шматочки стінки кишечника, печінки, селезінки, серця, легень, нирок) використали для гістологічних досліджень.

На четвертому етапі проведені гістологічні дослідження та проаналізовані їх результати.

На п’ятому етапі експериментально обґрунтували методи діагностики і систематизували способи профілактики циноглосотоксикозу; узагальнили та теоретично обґрунтувати патогенез при отруєнні чорнокоренем лікарським.

Результати досліджень оброблені статистично. Вірогідність різниці між середньоарифметичними даними визначали за критерієм Стьюдента. Вірогідними вважали різницю при р≤0,05

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Гострий перебіг циноглосотоксикозу в молодняка великої рогатої худоби

Бички дослідних груп відмовлялись від корму з трав’яним борошном і сухим листям і почали поїдати його тільки після додавання півдобової норми комбікорму та здобрювання суміші мелясою. Основні клінічні ознаки з’явились через 1,5–2 години після першого прийому корму і характеризувались пригніченням та порушенням роботи травного каналу.

Більш виражені зміни виявлено у тварин першої дослідної групи, які отримували борошно чорнокореня лікарського. Загальний стан у тварин змінювався в залежності від кількості з’їденого корму. Через 24 години від початку досліду загальний стан тварин був пригніченим, частота скорочень рубця за 5 хвилин зменшилась з 6,3±0,4 до 3,0±0,6. Спостерігали зниження температури тіла (36,8±0,5 ^ºС).

Тварини другої дослідної групи через 24 години від початку досліду мали задовільний загальний стан, скорочення рубця дещо сповільнені (за 5 хвилин 4,3±0,4 проти 6,0±0,5 до згодовування), температура тіла – в межах фізіологічних коливань (37,7±0,3 ^ºС). Частота скорочень рубця у телят контрольної групи залишалась у межах норми, температура тіла становила 38,3±0,4^ºС. При спостереженні протягом другого, третього і четвертого днів помітних порушень з боку органів дихання у тварин першої і другої дослідних груп не встановили.

Виявлені зміни у лейкограмі дослідних тварин дають підставу зробити висновок, що алкалоїди чорнокореня спричинюють патогенний вплив на органи гемопоезу. Через 24 години від початку згодовування чорнокореня лікарського у лейкограмі бичків першої дослідної групи відмічена тенденція до зменшення відсотку еозинофілів, у бичків другої і контрольної груп їх кількість не зазнала істотних змін. Через 72 години від початку досліду відсоток еозинофілів мав тенденцію до зменшення на 2,6 % у бичків першої і у другої дослідних груп, що, ймовірно, пов’язане з їх участю в адсорбції токсичних продуктів. В той же час кількість еозинофілів у молодняка контрольної групи не зазнала істотних змін.

Кількість паличкоядерних нейтрофілів через 24 години від початку досліду вірогідно зросла на 3,4 % (р≤0,05) у бичків першої дослідної групи і на 4,7 % (р≤0,01) – другої. В останній групі ця закономірність зберігалась і в наступний день. У тварин контрольної групи вірогідних змін не встановлено. Варто зазначити, що вихід молодих нейтрофілів у кров’яне русло був короткотерміновим – через 96 годин спостерігалася тенденція до зменшення їх кількості. Такі зміни кількості паличкоядерних нейтрофілів не можна характеризувати як регенеративне зрушення ядра.

Типовим для гострої інтоксикації є зменшення кількості сегментоядерних нейтрофілів через 48 годин після згодовування чорнокореня: у бичків першої дослідної групи – на 20 % (р≤0,001), другої – на 16 % (р≤0,001). Встановлені зміни цих клітин були стабільними і зберігалися до закінчення досліду. У показниках бичків контрольної групи істотних змін не відзначено. Отже, короткотермінове зростання кількості паличкоядерних нейтрофілів з наступним їх зменшенням та зменшення сегментоядерних свідчить про виражений токсичний вплив алкалоїдів чорнокореня лікарського на кістковий мозок та гальмування елімінації цих клітин у кров’яне русло.

Суттєвих змін кількості лімфоцитів через 24 години у бичків дослідних і контрольної груп не відмічено порівняно з початковими. Через 48 годин від початку досліду спостерігали вірогідне збільшення кількості лімфоцитів на 23,2% (р≤0,001) у бичків першої дослідної групи і на 13,6% (р≤0,001) у бичків другої порівняно з показниками перед дослідом. У бичків контрольної групи змін лімфоцитів не встановлено. Лімфоцитоз, який виявили у тварин обох груп, протікає на фоні різкого зменшення кількості нейтрофілів, тому ми трактуємо це як пригнічення захисних сил організму у відповідь на дію алкалоїдів чорнокореня лікарського.

Через 48 годин після згодовування чорнокореня відзначено вірогідне зменшення кількості моноцитів у тварин першої і другої дослідних груп на 2,7 % (р≤0,01) порівняно з початковими даними, а через 24, 72 і 96 годин вони у крові зовсім не виявлялись. Водночас, у бичків контрольної групи змін кількості моноцитів не встановлено. Моноцитопенія у бичків дослідних груп є показником пригнічення функції мононуклеарної фагоцитарної системи під впливом токсичних речовин чорнокореня лікарського.