СТАН РЕПРОДУКТИВНОЇ ФУНКЦІЇ НАЩАДКІВ СТРЕСОВАНИХ САМЦІВ ЩУРІВ

Краткое содержание

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на статевозрілих самцях щурів популяції Вістар з масою тіла 250-300 г віком чотири-шість місяців та їх нащадках обох статей різного віку. Всього в експериментах використано 1189 щурів різних вікових груп. Уci дослідження проводили відповідно до національних “Загальних етичних принципів експериментів на тваринах” (Україна, 2001), узгоджених з положеннями “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985). Щурів утримували в стандартних умовах віварію при природному освітленні та рекомендованому для них харчовому раціоні.

Моделювання порушення сперматогенної функції відтворювали шляхом стресування самців щоденною одногодинною іммобілізацією на спині з фіксацією обох пар лап протягом семи діб (Repčecova D., Mikulay Z., 1977).

Спаровування самців з інтактними самками здійснювали в різні строки після відміни стресування з урахуванням тривалості стадій сперматогенезу, а саме: через 1 добу, коли дії стресу підлягали зрілі епідидимальні спермії (група 2), через 15 діб – сперматиди (група 3), через 28 діб – сперматоцити (група 4), через 48 діб – сперматогонії (група 5). Контролем були інтактні самці, спаровані з інтактними самками (група 1).

У отриманих нащадків вивчали показники соматичного розвитку. Реєстрували час відлипання вушок, появи генералізованого волосяного покриву, прорізування зубів, відкриття очей; динаміку маси тіла; виживання. У щурят в першу добу життя вимірювали АГВ (ано-генітальна відстань). Показниками початку статевого розвитку щурят був термін опущення яєчок у мошонку та відкриття піхви.

Частину нащадків обох статей, отриманих від інтактних самців (група 1б), та стресованих самців (група 2б), спаровування яких з інтактними самками відбувалося через 28 діб після відміни стресування, піддавали дії семиденної іммобілізації з 40 доби життя за тією ж схемою, що й їх батьків. Контролем були інтактні нащадки (група 1а) та ті, які народились від самців, яких спаровували з інтактними самками через 28 діб після відміни стресування (група 2а).

За нащадками обох статей контрольної та піддослідних груп спостерігали до досягнення ними чотиримісячного віку. У самців-батьків та їх нащадків обох статей статевозрілого віку (120 діб) досліджували стан репродуктивної функції; у самців-батьків – оцінювали вплив стресування на процеси ВРО (вільнорадикальне окислення) і антиоксидантного захисту.

Статеву поведінку самців-батьків та їх нащадків чоловічої статі вивчали в парному тесті з оваріектомованими рецептивними самками. Тривалість тесту складала 15 хвилин. Вихідний рівень статевої активності досліджуваних самців оцінювали за результатами четвертого тесту. Реєстрували такі показники: кількість та латентні періоди (час від початку тесту до перших проявів статевої активності) садок, інтромісій та еякуляцій, постеякуляторний рефрактерний період (час між еякуляцією та початком наступної серії прояву статевої активності), кількість інтромісій до еякуляції (Буреш Я. та співавт., 1991).

У статевозрілих самок-нащадків статеву поведінку вивчали в стадії проеструс-еструс. До сумарного показника процептивної поведінки увійшли: знайомство (наближення самки до самця, обнюхування), «залицяння» (штовхання самця лапою, пробіг перед самцем), реагування на самця (тремтіння вух, стрибки, пробіжки). Оцінювався коефіцієнт лордозу (відношення кількості лордозних поз до загальної кількості садок, інтромісій та еякуляцій) як показник рецептивності самки.

Оцінку фертильності стресованих самців-батьків та їх нащадків чоловічої статі проводили за результатами їх спаровування з інтактними статевозрілими самками з регулярним естральним циклом. За першу добу вагітності вважали день появи у вагінальному мазку сперматозоїдів. Визначали індекси покриття (доля самок, які наступної доби мали у вагінальних мазках сперматозоїди) та вагітності (доля вагітних самок у групі). У декапітованих на 20 добу вагітності самок, яких спаровували з стресованими самцями, або на 12 добу вагітності нащадків жіночої статі та самок, яких спаровували з самцями-нащадками стресованих батьків, підраховували кількість жовтих тіл у яєчниках, місць імплантації та живих плодів у матці, на підставі чого визначали до- та післяімплантаційну загибель плодів і відсоток загальної ембріональної смертності (Бішовець Т.Ф., 2001). Рівень доімплантаційних втрат встановлювали за різницею між кількістю жовтих тіл у яєчниках та місць імплантації у матці, а рівень післяімплантаційної загибелі плодів – за сумою резорбцій та загиблих плодів у матці. У декапітованих на 20 добу вагітності самок вилучали та зважували плаценти і плоди, у яких вимірювали краніо-каудальний розмір.

Фертильність самок-нащадків стресованих та інтактних самців-батьків оцінювали після парування з інтактними здоровими самцями.

Спермограму самців-батьків (через 1, 15, 28 та 48 діб після відміни стресування) та їх нащадків чоловічої статі оцінювали за загальноприйнятою методикою (Леонтьєва О. А., 1999; Петрищев В. С., 2002; Карнаух В. І., 2005). Досліджували спермії, отримані із хвостової частини епідидимісу. Визначали концентрацію сперміїв, їх рухливість та відсоток патологічних форм.

У нащадків жіночої статі протягом 16 діб вивчали фазову структуру естрального циклу та його загальну тривалість.

Усіх тварин знеживлювали швидкою декапітацією. У самців-батьків та їх нащадків обох статей вилучали та зважували органи репродуктивної системи, надниркові залози, тимус, гіпофіз, відбирали зразки крові, з яких отримували сироватку.

У сироватці крові визначали рівні кортикостерону (R&D System, США), ПРЛ (пролактин) (АлкорБио, Росія), Т (тестостерон) та Е₂ (естрадіол) (Хема-Медика, Росія) імуноферментним методом, використовуючи стандартні комерційні набори.

Показники процесів ВРО і білків визначали в сім’яниках. Вміст речовин, які реагують з ТБК (тіобарбітурова кислота), визначали за методом Стальної І. Д. та Гаршвілі Г. Т. (1977); вміст карбонильованих білків – за методом Дубініної Е. Е. (2000); рівень ВГ (відновленого глутатіону) – за методом Арутюнян А. В. та співавторів (2002).

Контролем до всіх піддослідних груп були інтактні тварини відповідної статі та віку.