Т-2 ТОКСИКОЗ ТВАРИН (ПАТОГЕНЕЗ, ДІАГНОСТИКА, ЛІКУВАННЯ, ПРОФІЛАКТИКА)

Краткое содержание

         Дисертаційна робота виконувалась упродовж 2000-2005 років на кафедрі фармакології та токсикології Національного аграрного університету.    

Експериментальні дослідження виконані у проблемній лабораторії  мікотоксикозів тварин кафедри фармакології та токсикології, у стаціонарі та віварії  факультету ветеринарної медицини НАУ. Частина досліджень виконана в Інституті екогігієни і токсикології ім. Л. І. Медведя, МОЗ України.

         Перебіг хронічного Т-2 токсикозу щурів вивчали у двох дослідах. Перший проводили на білих щурах-самках, масою тіла в межах 320,1±5,3 г, яких утримували в групових клітках та годували повноцінною гранульованою кормосумішшю для щурів.

Для відтворення Т-2 токсикозу щурам щодня вводили всередину водно-спиртовий розчин токсину в дозі 0,76 мг/кг (1/5 DL₅₀).  Перебіг Т-2 токсикозу оцінювали за даними  клінічних спостережень, гематологічних і біохімічних досліджень крові. Кров відбирали шляхом декапітації наркотизованих ефіром тварин до введення токсину та через 12 і 21 доби після.

         У другому досліді використано білі щури-самки з середньою масою в межах  200,1±3,5 г, яких розподілили на 2 групи по 12 тварин у кожній. Тварини першої групи слугували контролем і отримували гранульовану кормосуміш. Тваринам другої групи до корму вводили Т-2 токсин з розрахунку 2 мг/кг маси тіла (1/2 DL₅₀). Перебіг Т-2 токсикозу оцінювали за даними клінічних спостережень та біохімічних досліджень плазми крові. Кров для досліджень відбирали через 7, 14 та 21 доби після початку досліду, шляхом декапітації наркотизованих ефіром щурів.

         Процеси вільнорадикального перекисного окиснення та стан неферментативної системи антиоксидантного захисту організму вивчали на білих молодих щурах з середньою масою тіла 170,1±5,2 г, яких розподілили на 3 групи по 12 тварин у кожній. Тварини контрольної групи отримували гранульовану кормосуміш; до корму тварин другої групи додатково було введено Т-2 токсин із розрахунку 2 мг/кг маси тіла. До корму щурів третьої групи вводили Т-2 токсин у кількості 2 мг/кг маси тіла та речовини, які забезпечують антиоксидантний захист організму, на кг корму: токоферолу ацетат – 70 мг, ретинолу пальмітат – 12000 ОД, холекальциферол – 6000 ОД,  аскорбінову кислоту – 250 мг. Доступ до води у тварин усіх груп був необмежений. Через 7, 14 та 21 добу відбирали кров від тварин кожної групи.

         Перебіг Т-2 токсикозу оцінювали за даними клінічних спостережень, біохімічних досліджень плазми крові та аналізу показників перекисного окиснення ліпідів (ТБК-активний продукт (малоновий діальдегід) у тканині печінки) та  неферментативної антиоксидантної системи захисту організму – вітаміну А у тканині печінки, вітаміну Е та аскорбінової кислоти у плазмі крові.     

         У двох дослідах на котах з середньою масою тіла 2,76±0,18 кг вивчали перебіг експериментального хронічного Т-2 токсикозу. Тварин утримували індивідуально у клітках. Годівля – стандартний корм “Kitekat”, вода без обмеження. 0,05%-вий розчин Т-2 токсину на 5%-вому етиловому спирті у дозі 0,05 мг/кг маси тіла змішували з 6-8 мл води і вводили перорально протягом 14 діб.

         Третій дослід на котах проведено з метою вивчення впливу унітіолу на перебіг   Т-2 токсикозу. Котам контрольної групи вводили перорально Т-2 токсин на 5%-вому етиловому спирті з розрахунку 0,05 мг/кг маси тіла. Тварини дослідної групи отримували Т-2 токсин у такій же дозі та унітіол у формі 5%-вого водного розчину у дозі 10 мг/кг маси тіла.

         Котів піддавали клінічному обстеженню, відбирали кров з яремної вени до введення токсину, через добу, 7 і 14 діб після для оцінки перебігу Т-2 токсикозу та ефективності дії унітіолу.

         На поросятах великої білої породи методом груп-періодів було проведено три серії дослідів. У першій та другій серіях дослідів використовували тварин віком 10 тижнів, масою 16,5±0,45 кг. У третій серії дослідів використовували поросят віком 15 тижнів, масою 24,3±0,85 кг. Дослідних поросят утримували в станках по дві тварини, годували два рази на день комбікормом для відгодівлі свиней до сальних кондицій (К 55 – 10/44 УКР – 501.78 К), напування вільне. Т-2 токсин свиням задавали з кормом упродовж двох тижнів, у першій серії дослідів 0,1 мг/кг маси тіла, у другій та третій – по 0,2 мг/кг. Після цього робили двохтижневу перерву, по закінченні якої згодовування токсину відновлювали.

         У першій серії дослідів після відновлення згодовування Т-2 токсину тваринам внутрішньом’язово вводили нукливет у дозі 2 мг/кг маси тіла, а у другій – 5 мг/кг маси тіла з метою вивчення його антитоксичної дії.

         У третій серії дослідів після двохтижневої перерви поросятам згодовували Т-2 токсин у дозі 0,2 мг/кг маси тіла та унітіол у дозі 30 мг/кг маси тіла.

         За тваринами велось клінічне спостереження та зважування після кожного періоду. До початку введення Т-2 токсину у тварин брали кров із орбітального венозного синусу для визначення контрольних показників, а через 7 і 14 діб  від початку введення та через 14 днів після припинення введення – для визначення параметрів токсичного впливу згаданого вище токсину на організм на основі результатів гематологічних, імунологічних та біохімічних досліджень. Після перерви взяття крові відновлювали через 7 та 14 діб з метою визначення ефективності нукливету у першій та другій серії досліджень і унітіолу – у третій.

         Для досліджень використовували  кристалічний Т-2 токсин, отриманий із культури гриба Fusarium sporotrichiodes у лабораторії Інституту птахівництва УААН, який люб’язно надав нам доктор ветеринарних наук Котик А.М. З Т-2 токсину  готували 0,05%-вий розчин на 5%-вому етиловому спирті.

          У крові визначали: кількість ретикулоцитів, еритроцитів, лейкоцитів та кров’яних пластинок (тромбоцитів) - шляхом підрахунку клітин в сітці камери Горяєва; концентрацію гемоглобіну - за допомогою набору реактивів “Human” (Німеччина) та з використанням КФК-2-УХЛ-4.2; лейкограму - шляхом підрахунку 100 клітин у мазках крові, пофарбованих за Романовським-Гімзою; фагоцитарну активність та фагоцитарний індекс нейтрофілів - в реакції із суспензією Staphylococcus aureus; кількість В-лімфоцитів визначали в реакції спонтанного розеткоутворення з еритоцитами миші; кількість Т-лімфоцитів - з еритроцитами барана; осмотичну резистентність еритроцитів - (Л.И. Идельсон, 1974); вміст молочної кислоти - за реакцією з параоксидифенілом (В.В. Меньшиков, 1982); вміст сечової кислоти - спектрофотометрично методом іонообмінної хроматографії на катіонообміннику DOWEX 50∙4 (200-400 Mesh, Н+форма); вміст циклічних пуринових нуклеотидів - cАМP та cGМP - радіоімунним методом з використанням стандартного набору реактивів; активність системи генерації оксиду азоту - шляхом встановлення  активності індуцибельної ізоформи NOS (iNOS) та вмісту стабільного метаболіту оксиду азоту - нітрит аніону (NO₂^-), а також вмісту стабільних низькомолекулярних нітрозотіолів. Концентрацію NO₂^-- визначали в безбілкових надосадових пробах після визначення активності NO-синтази за допомогою реактиву Грісса; активність неокисного шляху обміну L-аргініну тестували за активністю аргінази та вмістом сечовини. Активність аргінази визначали колориметричним методом за кількістю сечовини в реакції з діацетилмонооксимом, використовуючи стандартні тест-добірки “La Chema”. Рівень вільних радикалів визначали методом ЕПР  на радіоспектрометрі “Varian E-109”, США -  (Я.И. Ажипа, 1983);  глутатіонредуктазну активність в еритроцитах - спектрофотометричним методом за окисненням NADPH в NADP; глутатіонпероксидазну активність в еритроцитах - за окисненням глутатіону (У.А. Кузьминская, 1989). Цитохром Р-450 залежні N-деметилювальну та денітрозувальну активність в лімфоцитах    периферійної крові за С.В. Сноз, Н.П. Дмитренко (1993); концентрацію вільних   SH-груп з використанням 5,5¢-дитіобіс-(2-нітробензойної) кислоти                        (У.А. Кузьминская, 1989).

У плазмі крові визначали: активність аспарагінової та аланінової амінотрансфераз (АсАТ, АлАТ) - за допомогою набору реактивів SiMKO Ltd, Львів, з використанням КФК-2-УХЛ-4.2.; активність лактатдегідрогенази (ЛДГ) - за методом Савела-Товарека (В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1982). Активність сорбітолдегідрогенази (СДГ) визначали за зменшенням кількості NАDН₂              (В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1982); активність гамма-глутамілтрансферази (ГГТ) -  визначали з використанням стандартного набору АТ “Реагент”, м. Дніпропетровськ за утворенням забарвленого 4-нітроаніліну (В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1982); рівень ТБК активного продукту (малонового діальдегіду, МДА) - за утворенням в кислому середовищі забарвленого комплексу з тіобарбітуровою кислотою          (У.А. Кузьминская,1989); концентрацію аскорбінової кислоти - спектрофотометрично у реакції з 2,6-дихлорфеноліндофенолом (В.С. Асатиани, 1965); концентрацію вітаміну Е - за методом (Б.В. Зайцев, Т.Г. Демина,                  Е.А. Караченкова, 1977); рівень загального білка - за  допомогою набору реактивів “Human” (Німеччина); вміст альбуміну - за  біуретовою реакцією після осадження в плазмі крові інших білків сумішшю етанолу та трихлороцтової кислоти              (В.М. Холод, Г.Ф. Ермолаев, 1988); загальний рівень імуноглобулінів - методом осадження сульфатом цинку (В.М. Холод, Г.Ф. Ермолаев, 1988); імуноглобуліни класів G, А та М - методом радіальної імунодифузії в агарі за Манчіні, (В.М. Холод, Г.Ф. Ермолаев, 1988); білкові фракції - нефелометрично (И.П. Кондрахин, Н.В. Курилов, А.В. Малахов и др., 1985); рівень сечовини - диметилгліоксимним  методом (И.М. Петрунь, Н.К. Литвинчак, 1970); вміст креатиніну - за  допомогою набору реактивів АТ ”Реагент”, Дніпропетровськ; вміст глюкози - з  антроновим реактивом (П.М. Бабаскин, 1964); рівень пірувату - з 2,4 динітрофенілгідразином (П.М. Бабаскин, 1976); вміст магнію - мікрометодом за допомогою титанового жовтого (А.Д. Кристиан, А.К. Устинович, 1967); рівень неорганічного фосфору та загального кальцію - за допомогою набору реактивів SiMKO Ltd, Львів.

У тканині печінки визначали: рівень ТБК-активного продукту - за утворенням у кислому середовищі забарвленого комплексу з тіобарбітуровою кислотою (У.А. Кузьминская,1989); вітамін А - після омилення тканин печінки та  екстракції вітаміну А етиловим ефіром із наступною взаємодією з хлористоводневою кислотою (А.А. Душейко, 1989).

Вивчали також вплив тривалого надходження Т-2 токсину на приріст поросят.

Отримані результати оброблені статистично з використанням критерію Стьюдента за допомогою програмованого мікрокалькулятора “Електроніка МК-61” та персонального комп’ютера Celeron 600.

РЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Клінічні ознаки хронічної форми експериментального Т-2 токсикозу

     Щури виявилися стійкими до дії Т-2 токсину. Незалежно від дози вказаного вище токсину та часу його надходження в організм клінічні ознаки Т-2 токсикозу були мало помітними. Однак, незначне пригнічення, втрату блиску та скуйовдженість шерсті спостерігали у тварин, що використовувались у першому досліді уже через дві доби після надходження токсину. У наступні дні досліджень ці клінічні ознаки зникали, а розвивались некротичні явища на шкірі навколо рота та на грудних кінцівках. У тварин дослідної групи другого досліду (Т-2 токсин, 2 мг/кг корму) клінічні ознаки розвивались значно пізніше і зберігались до закінчення експерименту. Зокрема, втрата блиску та скуйовдженість шерсті проявились лише на десяту добу надходження токсину. У деяких тварин в окремі дні спостерігалось виділення несформованих калових мас, а вуха та кінцівки мали синюшний відтінок. Помітними були нервові явища, які супроводжувались сіпанням голови, а тварини були мало активними. Поїдання корму поступово зменшувалось і до закінчення експерименту не перевищувало 50-60% добової норми.                                                                      

У котів уже через 6 годин після надходження Т-2 токсину спостерігалось погіршення загального стану, яке характеризувалось пригніченням. У перші п’ять діб експерименту виявили блювоту. Одночасно в деяких із них спостерігався розлад травлення у вигляді діареї, що тривав до закінчення експерименту. Тварини поступово худнули, ставали “неохайними”, шерсть втрачала блиск, була скуйовдженою та липкою. До закінчення досліду наступало порушення координації руху, спостерігалась хитка хода та напруження скелетних м’язів. У двох тварин спостерігали глухі хрипи та виділення слизисто-гнійного ексудату із ніздрів, що дало можливість запідозрити розвиток запального процесу в дихальних шляхах.

Температура тіла котів упродовж дослідного періоду була в межах 37,5±0,28-39,1±0,10ºС.  Частота пульсу через 6 годин після надходження Т-2 токсину збільшувалась з 68,5±2,89 ударів/хв., до 118,5±5,43 ударів/хв. (Р<0,001). У подальшому його показник складав від 73,25±0,72 до 83,5 ±3,26 (Р<0,01) ударів/хв.

Частота дихання протягом доби після надходження токсину знаходилась в межах 24,5±1,1 - 27,75±0,36 дихальних рухів за хв. На 7-у добу вона становила 32,25±1,25 (Р<0,001) дихальних рухів за хв., а на 14-у - зменшувалась до 20,75±0,36.

На 11-у добу введення Т-2 токсину одна тварина, що використовувалась у другому досліді, загинула, а всі інші були виснаженими.  

У поросят, незалежно від дози токсину, в окремі дні спостерігалось виділення розріджених калових мас без явних ознак проносу. У деяких тварин, через 10-15 хвилин після прийому корму з’являлись потяг до блювання, а також акт блювоти. Крім того, слід відзначити “обережність” у тварин при прийомі корму, яка характеризувалась “чавканням”, зумовленим посиленим слиновиділенням та тривалим пережовуванням корму. Тварини періодично відходили від годівниць, терли ніс передніми ногами та жадібно пили воду. Свідченням дермонекротичної дії є поява на губах та  носовому п’ятачку виразок через 8-10 діб після згодовування корму з Т-2 токсином. У поросят поступово розвивались анемічні явища, які характеризувались блідістю слизових оболонок та сірим відтінком шкіри. Середньодобові прирости у поросят, що отримували Т-2 токсин у дозі 0,1 мг/кг маси тіла, через два тижні експерименту зменшувались на 16%, а у дозі 0,2 мг/кг - на 45%.

Про вплив Т-2 токсину на центральну та периферичну нервову систему свідчить  порушення координації руху, апатія та тремор скелетних м’язів.

Отже, на основі аналізу клінічних ознак хронічної форми Т-2 токсикозу у тварин різних видів робимо висновок про те, що їх прояв залежить від виду тварин, дози Т-2 токсину та особливостей його надходження в організм (одномоментно шляхом примусового введення чи поступово по мірі поїдання корму).