ТОКСИКО-ЕКОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ОМАЙТУ (ПРОПАРГІТУ)

Краткое содержание

Робота виконана в лабораторії токсикологічного моніторингу Центру токсикологічних досліджень Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН упродовж 2002-2005 років.

Для проведення досліджень використовували омайт, 57 % к.е. (реєстраційне посвідчення А 00402). Стандартні розчини пестициду готували в гексані  з концентрацією діючої речовини 1; 10 і 100 мкг/см³. В дослідах на тваринах використовували водні емульсії токсиканту. 

            При розробці методики визначення пестициду в об’єктах тваринного походження для детекції омайту (пропаргіту) обрали способи газорідинної та тонкошарової хроматографії. Для вилучення препарату з матриці досліджуваного об’єкту відпрацьовували методи його екстракції органічними розчинниками. Очищення екстрактів проводили шляхом фільтрації, виморожування, перерозподілу в системі розчинників, що не змішуються, та за допомогою хроматографії на колонках.

При проведенні валідації методики дотримувались вимог стандарту ISO 17025 і визначали такі параметри, як: специфічність, точність, лінійність, відтворюваність, межа визначення та детектування, збереженість пестициду в стандартному розчині та в досліджуваній матриці.

Для вивчення цитотоксичності омайту використовували культури клітин нирки вівці (ПО-2) і нирки зеленої мавпи (Vero). Ступінь токсичності визначали на нефіксованих культурах під малим збільшенням мікроскопу. Враховували цілісність моношару, ступінь його ураження, характер розміщення клітинних елементів, кількість клітин з округленою цитоплазмою.

            З метою вивчення впливу омайту на мітотичний режим культури клітин вирощували у пеніцилінових флаконах на накривних скельцях, які виймали після 24-, 48-, 72-, 96- і 120-годинного інкубування в термостаті. Клітини фіксували сумішшю льодяної оцтової кислоти і абсолютного етилового спирту у співвідношенні 1:3.  Фіксовані клітини фарбували за загально прийнятою методикою гематоксиліном Каррачі (Белоконь В.С. и др., 1993). При мікроскопічному дослідженні враховували кількість клітин в стані мітотичної активності, наявність і характер патологічних мітозів, відношення різних фаз мітозу.

            Визначення середньолетальної дози омайту для щурів за умови одноразового перорального уведення проводили згідно з методичними рекомендаціями “Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин” (1997). Обчислювали ЛД₅₀ методом найменших квадратів з використанням пробіт-аналізу в модифікації В.Б. Прозоровського (1962), а похибку – методом Miller’a і Tainter’a (1944).

            Токсикокінетику омайту в організмі ссавців і птиці після одноразового перорального уведення вивчали на моделі щурів і курей. Вміст залишкових кількостей пестициду в органах і тканинах через 4 години, 1; 3; 7; 14; 21 і 28 діб після уведення препарату визначали способом газорідинної хроматографії за розробленою нами методикою. Додатково, з метою вивчення шляхів виведення пестициду з організму ссавців, від щурів, після уведення їм омайту, щодоби збирали кал і сечу, які досліджували на наявність залишкових кількостей препарату.

            Токсичність омайту для птиці вивчали в умовах гострого експерименту при одноразовому пероральному уведенні препарату в дозах 300 і 600 мг/кг курям породи Хайсекс білий масою тіла 800-1000 г. За птицею вели спостереження, встановлювали строки появи і характер клінічних ознак отруєння, після забою оцінювали патологоанатомічні зміни внутрішніх органів. Крім того, проби крові та печінки отруєної птиці відбирали для  проведення гематологічних і біохімічних досліджень.

Для вивчення дерматотоксичності омайту використовували кролів чорно-вогняної породи масою тіла 2,5-3,3 кг. Препарат у формі 0,2 % водної і 57 % концентрат емульсії наносили на ділянку шкіри розміром 4х6 см в ділянці стегна в дозі 2 і 570 мг/кг маси тіла, відповідно. Спостереження за дослідними тваринами тривали впродовж 21 доби, при цьому враховували загальний стан піддослідних кролів, кількість корму та води, що споживались, глибину і характер уражень шкіри в місці аплікації пестициду, а також строки загибелі або видужання тварин.  Кров для проведення гематологічних і біохімічних досліджень відбирали з вушної вени на 1, 3, 7 і 14 добу після аплікації омайту.

            Для оцінки впливу досліджуваного пестициду на організм курей і кролів використовували наступні гематологічні тести: кількість еритроцитів визначали фотометричним методом на КФК-2 (Заболоцкий В.Т., 1965), кількість лейкоцитів підраховували у камері Горяєва, вираховували лейкоформулу (Кондрахін І.П., 1985), концентрацію загального гемоглобіну встановлювали за допомогою ацетонціангідридного методу (Строев Е.А., 1986).

            З біохімічних параметрів в плазмі крові дослідних тварин визначали активність трансаміназ із використанням комерційних наборів ТОВ НВП “Філісіт-Діагностика” (Україна, 2005 р.); вміст холестерину – за методом Ілька (Клисенко И.П., 1985), а загальних ліпідів – за реакцією з сульфофосфованіліновим реактивом. Про інтенсивність процесів вільнорадикального перекисного окиснення судили за рівнем дієнових кон’югатів і малонового діальдегіду, які визначали в плазмі крові і печінці (Мешкова Н.П., 1979; Гаврилова В.Б., 1983). Активність каталази визначали за реакцією з молібдатом амонію (Королюк М.А., 1988).  Для оцінки загальної антиоксидантної активності плазми використовували модельну систему, що являє собою суспензію ліпопротеїдів жовтка курячих яєць (Келебанов Г.И., 1988). Стійкість мембран еритроцитів до перекисного гемолізу визначали за методом Ягера (Jager F.C., 1968) та за реакцією з лимонною кислотою.

Вивчення персистенції омайту в об’єктах довкілля проводили в умовах приватного господарства Дергачівського району Харківської області після дворазової обробки яблунь і винограду пестицидом у дозах, рекомендованих виробником. Проби рослин і ґрунту відбирали кожні сім днів упродовж 14 тижнів. Визначення вмісту залишкових кількостей пестициду проводили способом газорідинної хроматографії за розробленою нами методикою. Всього за дослідний період було проаналізовано 44 проби ґрунту, 158 проб листя і трави та 41 пробу плодів (яблука, виноград, полуниця). Період, за який  вміст залишкових кількостей омайту на рослинах зменшувався вдвічі, визначали шляхом математичної моделі кінетичного процесу першого порядку (Голубев А.А. и др., 1973).

            Статистичний аналіз отриманих резулитатів проводили за допомогою редактора електронних таблиць Excel 2000.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

  Розробка методики визначення омайту (пропаргіту) в об’єктах тваринного походження та її валідація. Існуючі в Україні методики визначення залишкових кількостей омайту в рослинах, воді та ґрунті мають ряд недоліків, пов’язаних з технікою виконання робіт і неможливістю прямого їх використання для аналізу біосубстратів. Тому, ми мали розробити економну та чутливу методику визначення залишкових кількостей омайту в об’єктах тваринного походження.

Відпрацьовували два шляхи детекції пестициду: способом газорідинної і тонкошарової хроматографії.

У першому випадку визначення пестициду проводили на газорідинному хроматографі з детектором постійної швидкості рекомбінації “Цвет-500”. Скляну колонку приладу довжиною один метр заповнювали хроматоном inerton-super /0,16-0,20/ з нанесеною рідинною фазою SE-30 у кількості 5 %. Як газ-носій використовували азот особливої чистоти. Шляхом експериментального підбору різних режимів роботи хроматографу визначили, що оптимальними для детекції омайту є наступні температури робочих термостатів: випарювача – 250°С, колонки – 240°С,  детектору – 260°С, та швидкість подачі газу на колонку 30 см³ за хвилину. Мінімальна кількість омайту (пропаргіту), що детектується,  при цьому дорівнювала 4 нг.

            При визначенні пестициду способом тонкошарової хроматографії дослідження були спрямовані на пошук реактиву або суміші реактивів, які б проявляли омайт на хроматографічних пластинках, а також такої рухомої фази розчинників, яка б забезпечувала R_f препарату на рівні 0,7-0,8.

Найбільш придатним для візуалізації омайту виявився спосіб, який базується на подвійній обробці хроматографічних пластинок: спочатку 2 N спиртовим розчином калію гідроксиду з наступним їх прогріванням протягом 7 хвилин при 110°С, а потім ацетоновим розчином солі діазонію. При цьому в лужному середовищі відбувається розклад омайту з утворенням спиртів, які окислюються сіллю діазонію до альдегідів, а альдегіди у свою чергу реагують з залишками солі діазонію з утворенням забарвлених продуктів. За результатами наших досліджень найкращим реактивом для виявлення пестициду з солей діазонію був стійкий синій Б. Омайт проявлявся у вигляді плям жовтого кольору на темно-фіолетовому фоні. При обробці пластинок стійким червоним В або ГГ межа в забарвленні плям препарату і фоном була менш чіткою.

При визначенні рухомої системи спочатку перевіряли різні розчинники в чистому вигляді: гексан, бензол, ацетон, хлороформ та ефір. При цьому встановили, що R_f омайту в гексані дорівнювало нулю, тобто препарат залишався на лінії старту. В ацетоні і ефірі препарат піднімався за фронтом розчинника. R_f омайту в хлороформі і бензолі  становило 0,45 і 0,64, відповідно, причому плями препарату були вертикально розтягнуті. Таким чином, жоден з вище зазначених  розчинників не відповідав висунутим до рухомої фази вимогам. Тому випробували суміші розчинників: гексан-ефір у співвідношенні 1:1; 3:2 і гексан-ацетон у співвідношенні 1:1; 3:2. При цьому встановили, що R_f омайту в сумішах гексан-ефір 3:2 і гексан-ацетон 1:1 дорівнювало 0,82 і 0,96, відповідно, тобто було завелике. А в сумішах гексан-ефір 1:1 і гексан-ацетон 3:2 коливалось від 0,68 до 0,76. Проте при хроматографуванні в системі гексан-ефір плями омайту були горизонтально розтягнутими і мали вигляд овалу, а в системі гексан-ацетон – плями за формою наближались до кола. Тобто оптимальною рухомою системою для визначення омайту виявилась суміш гексану й ацетону в співвідношенні 3:2. Межа детектування омайту тонкошаровою хроматографію при цьому складала 1 мкг.

У подальшій роботі наші зусилля були спрямовані на розробку способу вилучення пестициду із матриці, що досліджується, очищення та концентрування екстрактів. Як матрицю використовували м’ясо, молоко, жир, жовток курячого яйця. Оптимальним екстрагентом омайту виявився ацетон, який забезпечував максимальне вилучення внесеного препарату з біосубстратів. Проте разом з препаратом в екстракт переходили і такі небажані компоненти, як ліпіди, каротиноїди тощо.

Очищення проб проводили у декілька етапів. Спочатку ацетоновий екстракт відфільтровували у чистий флакон крізь паперовий фільтр і звільняли від жирових домішок шляхом їх виморожування при температурі мінус 18 – 20ºС впродовж однієї години. На цьому етапі для кращого очищення до екстрактів додавали дистильовану воду в співвідношенні 4:1, відповідно. Далі з водно-ацетонового розчину омайт переводили в гексан. Доочищення гексанового реекстракту проводили за допомогою хроматографії на розподільчих колонках. Як сорбент виступав оксид алюмінію ІІ ступеня активності. Нами було встановлено, що при внесенні в хроматографічну колонку 9-10 см³ гексанового реекстракту омайт повністю адсорбується на оксиді алюмінію. Після чого достатньо внести лише 3 см³ суміші  гексан-ацетону 19:1, щоб елюювати його з колонки. Таким чином, відбувається концентрування препарату та забезпечується  достатньо якісне очищення екстрактів від коекстрактивних речовин для проведення подальшої ідентифікації препарату способами газорідинної або тонкошарової хроматографії.

Після розробки методики визначення залишкових кількостей омайту (пропаргіту) в об’єктах тваринного походження були проведені експериментальні дослідження зі встановлення її валідаційних параметрів. Як біологічну матрицю використовували молоко, в яке штучно вносили відому кількість пестициду.

Встановлено, що розроблена методика є специфічною, точною, лінійною та відтворюваною. Межа визначення омайту способом газорідинної хроматографії дорівнює 0,028 мг/кг, а способом тонкошарової – 0,645 мг/кг. В стандартному гексановому розчині омайт не руйнується впродовж чотирьох тижнів, проте оптимальними умовами його зберігання є посуд з темного скла і температура плюс 4ºС та мінус 20ºС. При цьому максимально припустимий термін зберігання зразків молока для дослідження на вміст омайту в умовах морозильної камери побутового холодильнику (при температурі мінус 20ºС) становить один тиждень.

Наукова новизна означених в методиці способів детекції омайту захищена деклараційними патентами України на винахід: деклараційний пат. № 20031212176 Україна, 7 G01N33/00 “Спосіб визначення омайту(пропаргіту) в біологічних об’єктах”; деклараційний пат. № 20031213026 Україна, 7 G01N33/00 “Спосіб виявлення омайту (пропаргіту) на тонкошарових хроматограмах”.

На основі проведених досліджень оформлено “Методичні вказівки щодо визначення омайту (пропаргіту) в об’єктах тваринного походження (м’ясо, жир, молоко, яйце) способами газорідинної та тонкошарової хроматографії”, які затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (наказ № 53 від 30 червня 2005 р.) і рекомендовані для використання у практиці ветеринарної медицини.

Дослідження цитотоксичної дії омайту на перещеплюваних культурах клітин. Визначення токсичності омайту in vitro проводили на перещеплюваних культурах клітин нирки вівці (ПО-2) та нирки зеленої мавпи (Vero). Пестицид вносили до живильного середовища в десятикратних розведеннях від 2000 до 0,2 мкг/см³. За результатами наших спостережень, при внесенні розчину омайту в живильне середовище культури ПО-2 в дозі 2000 мкг/см³ відбувалось округлення, роз’єднання клітин моношару і відторгнення їх з поверхні скла. При зменшенні дози в десять разів лише поодинокі округлені клітини залишились прикріпленими до поверхні скла культуральних посудин через 24 години після внесення препарату. При дозі омайту 20 мкг/см³ більше ніж 40-50 % клітин залишились живими, але більшість з них відторгалась на 2-3 добу після початку досліду. При дозі 2 мкг/см³ омайт спричиняв появу віконець у моношарі культури на 3-ю добу після внесення та сприяв швидкому старінню клітин. В дозі 0,2 мкг/см³ були помічені лише поодинокі круглі клітини з ознаками інтоксикації на фоні маси нормальних. Така ж картина  токсичного впливу пестициду спостерігалась і на культурі Vero, але вона виявилась більш чутливою до дії омайту. Середньотоксичні дози для культур клітин Vero і ПО-2 склали, відповідно,  2 і 20 мкг/см³ живильного середовища.