ВИДІЛЕННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА БІЛКОВИХ ЧИННИКІВ, ЩО ЗВ’ЯЗУЮТЬ ІНСУЛІН В КРОВІ ЛЮДЕЙ, ХВОРИХ НА ЦУКРОВИЙ ДІАБЕТ : ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВЫХ ФАКТОРОВ, связывающие инсулина в крови ЛЮДЕЙ, БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ

Краткое описание

ІНСТИТУТ ЕНДОКРИНОЛОГІЇ ТА ОБМІНУ РЕЧОВИН

ім. В.П. КОМІСАРЕНКА

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

На правах рукопису

МЕЛЬНИЧЕНКО Світлана Вітаськівна

УДК 616.379-008.64:616.153.96-07-097

ВИДІЛЕННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА БІЛКОВИХ ЧИННИКІВ,

ЩО ЗВ’ЯЗУЮТЬ ІНСУЛІН В КРОВІ ЛЮДЕЙ,

ХВОРИХ НА ЦУКРОВИЙ ДІАБЕТ

14. 01. 14 ендокринологія

Дисертація

на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Науковий керівник:

доктор медичних наук

Корпачев Вадим Валерійович

Київ - 2008

ЗМІСТ

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

4

ВСТУП

5

РОЗДІЛ 1.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

11

1.1.

Антитіла до інсуліну та інші білкові чинники, що зв’язують інсулін в сироватках крові здорових людей та хворих на ЦД

11

1.2.

Методи виявлення антитіл до інсуліну в сироватках крові людей

30

РОЗДІЛ 2.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

41

2.1.

Відокремлення антитіл до інсуліну від інших сироваткових білків, що зв’язують інсулін, методом афінної хро­­ма­тографії на сорбентах з інсуліном та білком А чи G

41

2.2.

Аналіз білкових фракцій, отриманих після афінної хроматографії, сироваток крові методом електрофорезу в поліакриламідному гелі

44

2.3.

Опрацювання методу твердофазного гетерогенного імуноферментного аналізу для визначення антитіл до інсуліну в сироватках крові людей

44

2.4.

Виділення антитіл до інсуліну з сироваток крові хворих на ЦД для використання їх як позитивного контролю при розробці імуноферментного методу визначення ІА та ІАА в крові людей

47

2.5.

Визначення чутливості, специфічності та відтворюваності опрацьованого імуноферментного методу для визначення ІА та ІАА

48

2.6.

Порівняння створеної імуноферментної тест-системи ІФА-АТ-інс” з комерційними наборами для визначення антитіл до інсуліну

49

2.7.

Загальна характеристика осіб, обстежених на вміст антитіл до інсуліну

50

РОЗДІЛ 3.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ

ОБГОВОРЕННЯ

53

3.1.

Виділення білків, що зв’язують інсулін у сироватках крові хворих на ЦД та здорових людей методом афін­ної хроматографії та аналіз отриманих фракцій з застосуванням електрофорезу в ПААГ

53

3.2.

Відпрацювання умов проведення імуноферментного аналізу (ІФА) для визначення антитіл до інсуліну в сироватках крові людей

60

3.3.

Встановлення чутливості, специфічності й відтво­рю­ва­­ності розробленого імуноферментного методу для визначення антитіл до інсуліну в сироватках крові людей

75

Список литературы

ВИСНОВКИ

Вперше застосовано метод поетапної афінної хроматографії на сорбентах з інсуліном та білком А (або G) і продемонстровано його придатність для відокремлення антитіл до інсуліну від інших білків, що зв’язують інсулін в сироватках крові хворих на ЦД та здорових людей. Показано, що вміст білкових чинників, причетних до зв’язування інсуліну, в сироватках хворих на ЦД в 2,5 3 рази вищий, ніж у здорових людей.

Вперше в Україні розроблено метод гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу для визначення вмісту антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів у крові людей. Доведено його ефективність для виявлення ІА та ІАА, як в цільній сироватці крові людей, так і у складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з цих сироваток.

Встановлено, що специфічність розробленого імуноферментного методу становить 90,9 %, а чутливість 82,4 %; внутрішньосерійний коефіцієнт варіації складає 9,09 % для негативних зразків і 3,53 % для позитивних, а міжсерійний 4,34 % для негативних зразків і 5,5 % для позитивних.

На основі розробленого методу створено вітчизняну імуноферментну тест-систему ІФА-АТ-інс” та показано її придатність для виявлення ІА та ІАА при обстеженні здорових людей та хворих на ЦД.

За допомогою розробленої тест-системи проведено визначення антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів в сироватках крові здорових людей, та хворих на ЦД-1 і ЦД-2, які приймали таблетовані цукрознижуючі препарати, ін’єкції інсуліну або його аналогів. Відсоток осіб, у крові яких виявлено ІА або ІАА, у групі хворих на ЦД-1 дорівнював 10,96; у хворих на ЦД-2, лікованих інсуліном 4,26; хворих на ЦД-2, які не отримували інсулін 1,92. Серед донорів ІАА виявлено у однієї особи (0,52 % від загальної кількості обстежених).

Проведене порівняльне дослідження тест-системи ІФА-АТ-інс” з імуноферментною комерційною системою Anti-insulin ORG-520” виробництва фірми ORGentech” (Німеччина), засвідчило її ефективність при визначенні антитіл до екзогенного (або ендогенного) інсуліну.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Тронько М.Д., Корпачев В.В. Основи клінічної фармакології цукрового діабету та його ускладнень // Київ.- Книга плюс.- 2004.- 103 с.

2. Корпачев В.В. Инсулин и инсулинотерапия // К.: РИА Триумф”.- 2001.- 456 с.

3. Schloot N.C., Roep B.O., Wegmann D., Yu L., Chase H.P., Wang T., Eisen­barth G.S. Altered immune response to insulin in newly diagnosed compared to insulin-treated diabetic patients and healthy control subjects // Dia­be­to­lo­gia.- 1997.- V.40.- P.564-572.

4. Davidson J., Feneberg S., De Meyts P., Feneberg N., Galloway J. Immu­no­lo­gical and metabolic responses of patients with history of antibody-induced beef insulins resistance to treatment with beef, pork, human, and sulfate beef insulin // Diabetes Care.- 1992.-V.15.- P.702-704.

5. Federlin K.F. Frontiers in insulin farmacology: international symposium // Hamburg, Stuttgart, New York; Thieme. 1993. С. 49-59.

6. Alp H., Recant L. Studies of the insulin-inhibitory effect of human albumin fractions // J. Clin. Invest.- 1965.-V.44, N 3.- Р. 870-882.

7. Жвирблене А.А., Барбашов С.Ф., Северин Е.С. Выделение и изучение свойств ин­су­­линсвязывающего белка сыворотки крови // Пробл. эндо­кри­нол.- 1988.- N 4.- С. 64-68

8. Yamanaka Y., Wilson E.M., Rosenfeld R.G., Oh Y. Inhibition of insulin receptor ac­ti­va­ti­on by insulin-like growth factor binding proteins // J. Biol. Chem.- 1997.- V.272, N 49.- Р. 30729-30734

9. Вельбери С.К., Керге Я.Х., Лилеорг А.А. Значение инсу­лин­свя­зы­ваю­щей активности сыворотки больных сахарным диабетом // Сов­ре­мен­ные проблемы эксперимертальной и клинической эндокринологии: Тез. докл. К.: 1987.- С. 60-61.

10. Antoniades H., Gundersen K. Studies on the state of insulin in blood: the state and transport of insulin in blood // Endocrinology.- 1961.-V.68, N 1.-Р. 7-16.

11. Ляпина Л.А., Кудряшов Б.А., Баратова Л.А. Характеристика белка, вы­де­ленного из альбуминовой фракции крови в норме и при диабете // Вопр. мед. химии.- 1987.- № 6.- С.69-71.

12. Root-Bern­s­tel R.S., Dobbelstein C. Insulin binds to glucagon forming a complex that is hyper-antigenic and inducing complementary antibodies having an idiotype-antiidiotype relationship // Autoimmunity.- 2001.-V.33, N 3.- Р.153-169.

13. Ronkainen M.S., Hamalainen A.M., Koskela P., Akerblom H.K., Knip M. Pregnancy induces nonimmunoglobulin insulin-binding activity in both maternal and cord blood serum // Clin. Exp. Immunol.-2001.- V.124.- P.190-196.

14. Kumar D. Lispro analog for treatment of generalized allergy to human in­sulin // Diabetes Care.-1997.- V.20.- P. 1357-1359.

15. Jeandidier N., Boullu S., Busch-Brafin M., Chabrier G., Sapin R., Gasser F., Pinget M. Comparison of antigenicity of Hoechst 21PH insulin using either implantable intraperitoneal pump or subcutaneous external pump infusion in type 1 diabetic patients // Diabetes Care.- 2002.- V.25.- P.84-88.

16. Lindholm A., Jensen L., Home P., Raskin P., Boehm B., Rastam J. Immune responses to in­sulin aspart and biphasic insulin aspart in people with type 1 and type 2 diabetes // Diabetes Care.- 2002.- V.25.- P.876-882.

17. Ривз У. Иммунология диабета и иммунотерапия. Последние дости­же­ния в клинической иммунологии. // Под ред. Томпсона Р. М.: Москва.- 1983.- С.253-304.

18. Ganz M., Unterman T., Roberts M., Uy R., Sahgal S., Samter M., Grammer L. Resistance and allergy to recombinant human insulin // J. Allergy Clin. Immunol.- 1990.- V.86, N 1.- P.45-51.

19. Wichterle D., Stolba P., Bendlova B., Krnakova A. Anti-insulin antibodies and insulin resistance // Unitr Lek.- 1995.- V.41, N 2.- Р. 146-150

20. Kim M., Sheler L., Mansharamani N., Haug M., Faiman C., Gupta M. Insulin antibodies and hypoglycemia in diabetic patients. Can a quantitative analysis of antibody binding predict the risk of hypoglycemia // Endocrine.- 1997.- V.6, N3.- P.285-291.

21. Lahtela J., Khip M., Paul R., Antonen J., Salmi J. Severe antibody-mediated human insulin resistance: successful treatment with the insulin analog lispro // Diabetes Care.- 1997.- V.20.- P.71-73.

22. Kellerer M., Lammers R., Haring H. Insulin signal transduction: possible me­chanisms for insulin resistance // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes.- 1999.- V.107.- P.97-106.

23. Dean B.M., Becker F., McNally J.M., Schwartz G., Gale E.A., Bottazzo G.F. Insulin antibodies in the pre-diabetic period: correlation with islet cell an­tibodies and the development of diabetes // Diabetologia.-1986.-V.29.- Р.339-342.

24. Atkinson M.A., Maclaren N.K., Riley W.J., Winter W.E., Fisk D.D., Spillar R.P. Are in­su­lin autoantibodies markers for insulin-dependent diabetes mel­li­tus? // Diabetes.-1987.-V.35.- Р.894-898

25. Ziegler A.G., Hummel M., Schenker M., Bonifacio E. Autoantibody ap­pea­rance and risk for development of childhood diabetes in offspring of parents with T1D. The 2-year analysis of the German BABYDIAB study // Dia­be­tes.-1999.- V.48.- Р.460-468

26. Stankewich W., Fichna P., Korman E., Rewers M. insulin autoantibodies as an age dependent risk marker for type 1 diabetes in children of different population // Diabetologia.-2001.-V.44 (1).- Р. A256

27. Зак К.П., Малиновская Т.Н., Тронько Н.Д. Иммунитет у детей, больных сахарным диабетом //-К.: Книга плюс.-2002.- 112 с.;

28. Palmer J.P., Asplin C.M., Clemons P., Lyen K., Tatpati O., Raghu P.K., Pa­c­quette T.L. Insulin antibodies in insulin dependent diabetics before in­su­lin treatment // Science.- 1983.-V.222.- Р.1337-1339

29. McEvoy R.