Блохіна Оксана Григорівна Біохімічні показники крові за розвитку експериментального запалення суглобу та за умов профілактичного введення хондроїтин сульфату

Краткое описание

Блохіна Оксана Григорівна, лікар-лаборант-імунолог КНП «Київська міська клінічна лікарня № 17». Назва дисертації: «Біохімічні показники крові за розвитку експериментального запалення суглобу та за умов профілактичного введення хондроїтин сульфату». Шифр та назва спеціальності 03.00.04 біохімія. Спеціалізована рада Д 26.001.24, Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Міністерство освіти і науки України
Кваліфікаційна наукова
праця правах рукопису
БЛОХІНА ОКСАНА ГРИГОРІВНА
УДК 616.7:615.2/.3:577.125.8
ДИСЕРТАЦІЯ
БІОХІМІЧНІ ПОКАЗНИКИ КРОВІ ЗА РОЗВИТКУ
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЗАПАЛЕННЯ СУГЛОБУ ТА ЗА УМОВ
ПРОФІЛАКТИЧНОГО ВВЕДЕННЯ ХОНДРОЇТИН СУЛЬФАТУ
03.00.04 – біохімія
09 - Біологія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне джерело
_______________О.Г. Блохіна
Науковий керівник: Дворщенко Катерина Олександрівна, д. б. н., с. н. с.
Київ – 2021

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ................................... 13
ВСТУП............................................................................................................. 16
РОЗДІЛ 1. Огляд літератури........................................................................ 22
1.1. Етіологія та патогенез захворювань суглобів 22
1.2. Біохімічні зміни у суглобі за умов розвитку запалення 29
1.3. Лікування та профілактика патологічних станів суглобів 33
РОЗДІЛ 2. Матеріали та методи досліджень……...............................… 43
2.1. Використані матеріали та реактиви................................................ 43
2.2. Умови проведення експерименту.................................................... 44
2.3. Гістологічний аналіз зрізів навколосуглобових тканин щурів..........45
2.4. Отримання сироватки крові щурів................................................... 46
2.5. Визначення вмісту цитокінів та факторів росту 47
2.6. Визначення концентрації С-реактивного білка 48
2.7. Визначення концентрації молекул низької молекулярної маси 48
2.8. Визначення вмісту супероксидного радикалу 49
2.9. Визначення вмісту гідроген пероксиду 50
2.10. Визначення вмісту дієнових кон’югатів та шиффових основ 50
2.11. Визначення вмісту ТБК-активних продуктів 51
2.12. Визначення вмісту продуктів окисної модифікації білків 52
2.13. Визначення вмісту загальних, білок-зв’язаних та небілкових SHгруп 53
2.14. Визначення каталазної активності........................................................54
2.15. Визначення супероксиддисмутазної активності.................................55
2.16. Визначення глутатіонпероксидазної активності ......................... 56
2.17. Визначення глутатіонтрансферазної активності.................................56
2.18. Визначення глутатіонредуктазної активності.................................. 56
11
2.19. Визначення вмісту відновленого та окисленого глутатіону ............. 57
2.20. Визначення концентрації білка.......................... 58
2.21. Кількісна ЗT-ПЛР............................................................................... 58
2.21.1. Виділення загальної РНК.......................... 58
2.21.2. Оцінка рівня експресії генів................................................ 59
2.22. Статистична обробка отриманих результатів................................. 60
РОЗДІЛ 3. Результати досліджень та їх обговорення.............................. 61
3.1. Оцінка ступеню запалення в організмі щурів за умов каррагінаніндукованого запалення суглобу та тривалого профілактичного введення
хондроїтин сульфату 61
3.1.1. Гістологічний аналіз навколосуглобових тканин 61
3.1.2. Концентрація С-реактивного білка у сироватці крові 64
3.1.3. Рівень молекул середньої молекулярної маси у сироватці
крові 67
3.1.4. Концентрація цитокінів у сироватці крові (ІЛ-1β, ІЛ-12В р40, ФНПα, ТФР-β, ІЛ-4, ІЛ-10) 70
3.2. Інтенсивність вільнорадикальних процесів у сироватці крові щурів за
умов каррагінан-індукованого запалення суглобу та тривалого
профілактичного введення хондроїтин сульфату............................. 83
3.2.1. Вміст активних форм кисню..................................................... 83
3.2.2. Вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів.................... 87
3.2.3. Вміст продуктів окисної модифікації білків........................... 93
3.3. Стан антиоксидантної системи у сироватці крові щурів за умов
каррагінан-індукованого запалення суглобу та тривалого
профілактичного введення хондроїтин сульфату…………………….. 98
3.3.1. Ферменти антирадикального захисту ………………….…. 99
3.3.2. Глутатіонова антиоксидантна система …………. 103
12
3.4. Рівень експресії ряду генів, залучених до розвитку запалення у крові
щурів за умов каррагінан-індукованого запалення суглобу та тривалого
профілактичного введення хондроїтин сульфату….. 114
3.4.1. Рівень експресії мРНК гену Ptgs2 (циклооксигенази) 114
3.4.2. Рівень експресії мРНК гену Nos2 (індуцибельної
нітрооксидсинтази) 116
3.4.3. Рівень експресії мРНК гену Tgfb1 (трансформуючого фактора
росту бета) 118
3.4.4. Рівень експресії мРНК гену Nfkb1 (транскрипційного фактору NFκB) 121
РОЗДІЛ 4. УЗАГАЛЬНЕННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ......... 125
ВИСНОВКИ.................................................................................................. 132
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ.................................................. 134
Додаток 1…………………………………………...………………………. 161
13
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
АОС — антиоксидантна система
АФК — активні форми кисню
ВООЗ — Всесвітня організація охорони здоров’я
ГА — глікозамін
ГАГ — глікозаміноглікан
ГЛП — глутатіонпероксидаза
ГЛР — глутатіонредуктаза
ГЛТ — глутатіонтрансфераза
ДК — дієнові кон’югати
ДНФГ — динітрофенілгідразин
ДТНБК — 5,5'-дитіо-біс-2-нітробензойна кислота
ЕІ — ендогенна інтоксикація
ІЛ — інтерлейкін
КАТ — каталаза
КС — кератан сульфат
МІА — монойодацетат натрію
ММП — матриксні металопротеїнази
МСК — мезенхімальні стовбурові клітини
МСММ — молекули середньої молекулярної маси
НАД+ — нікотинамідаденіндинуклеотид окиснений
НАДН — нікотинамідаденіндинуклеотид відновлений
НАДФН — нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат відновлений
НПЗП — нестероїдні протизапальні препарати
НСТ — нітросиній тетразолій
ОА — остеоартрит
ОМБ — окисна модифікація білків
ОП — олігопептиди
14
ОРА — опорно-руховий апарат
ОС — окисний стрес
ПГ — простагландин
ПЛР — полімеразна ланцюгова реакція
ПОЛ — перекисне окиснення ліпідів
СОД — супероксиддисмутаза
СРБ — С-реактивний білок
ТБК — тіобарбітурова кислота
ФНП-α — фактор некрозу пухлин α
ХС — хондроїтин сульфат
ЦОГ — циклооксигеназа
ШО — шиффові основи
COMP — сartilage oligomeric matrix protein
GSH — reduced glutathione
GSSG — oxidized glutathione
H2O2 — пероксид водню
iNOS — іnducible nitric oxide synthase
NF-kB, Nfkb1 — nuclear factor-kappa B
NO — монооксид азоту
NOS — nitric oxide synthase
Nos2 — nitric oxide synthase 2 (inducible)
О2
- — супероксид аніон радикал
Ptgs2 — prostaglandin-endoperoxide synthase 2
RANKL — receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand
SNP — single-nucleotide polymorphism
TGF-β1, Tgfb1 — transforming growth factor beta 1
TLR — toll-liked receptors
TNF-α — tumor necrosis factor-alpha
15
XTT — 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-
carboxanilide
16
ВСТУП
Актуальність теми. На сьогоднішній день захворювання опорно-рухового
апарату є актуальною проблемою медицини, а їх профілактика та лікування має
першочергове значення для збереження здоров’я населення. Провідне місце серед
хвороб опорно-рухової системи займають захворювання суглобів. Вони
супроводжуються розвитком запальних процесів, як на рівні компонентів суглобу,
включаючи синовіальну оболонку, хрящ, суглобову капсулу, зв’язки, сухожилля,
субхондральну кістку, так і на рівні цілого організму [13, 142, 148, 238]. Важливу
роль у розвитку та прогресуванні запалення у суглобах відіграє оксидативний
стрес, який виникає внаслідок постійної генерації вільних радикалів
активованими фагоцитами та за рахунок гіпоксичних процесів при роботі
суглобів, що призводить до пошкодження синовіальних клітин, деструкції
хрящової тканини, ерозії кісток та суглобових поверхонь. Крім того, при
надмірному утворенні вільних радикалів спостерігається виснаження всіх ланок
антиоксидантного захисту, що також сприяє формуванню пошкоджень тканин
суглобового апарату [82].
Оскільки захворювання опорно-рухового апарату, зокрема суглобів, мають
прогресуючий характер, необхідно своєчасно приймати міри для того, щоб
зупинити або пригальмувати розвиток патологічних змін у організмі. Важливим є
проведення ефективної профілактики даних захворювань, особливо, якщо є
генетична схильність до розвитку хвороб суглобів, при професійній ймовірності
перевантаження опорно-рухового апарату, переохолодженні, а також у людей
похилого віку.
В зв’язку з цим, важливим питанням є пошук засобів для відновлення
суглобів. Відомо, що дистрофічні зміни хрящової тканини пов’язані зі зниженням
вмісту хондроїтин сульфату, який є природнім компонентом міжклітинної
речовини хряща. Дослідженнями останніх років показано, що хондроїтин сульфат
виконує нетільки структурну функцію в суглобі, але і володіє антиоксидантними
17
та антизапальними властивостями [158, 199, 251]. Тому дослідження препаратів,
основу яких складає хондроїтин сульфат, є перспективним у профілактиці та
лікуванні захворювань суглобів.
Дана дисертація присвячена вивченню профілактичної дії
хондропротектора на основі хондроїтин сульфату на розвиток запальних процесів
при карагінан-індукованому запаленні суглобу щурів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота була виконана на кафедрі біохімії Навчальнонаукового центру «Інститут біології та медицини» Київського національного
університету імені Тараса Шевченка у рамках науково-дослідних тем «Механізми
метаболічних процесів в організмі за умов патологічних станів»
(№ д/р 0116U002527, 2016-2018 рр.) та «Розробка методичних рекомендацій
використання хондропротекторів та мультипробіотиків для корекції патології
суглобів» (№ д/р 0118U000243, 2018-2020 рр.).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити
профілактичну дію хондроїтин сульфату на біохімічні показники крові за умов
розвитку каррагінан-індукованого запалення суглобу.
Відповідно до мети дисертаційного дослідження поставлено наступні
завдання:
1. Оцінити ступінь розвитку запалення у щурів при каррагінаніндукованому запаленні суглобу та профілактичному введенні хондроїтин
сульфату.
2. Визначити інтенсивність вільнорадикальних процесів у сироватці
крові щурів при каррагінан-індукованому запаленні суглобу та профілактичному
введенні хондроїтин сульфату.
3. Оцінити стан антиоксидантної системи у сироватці крові щурів при
каррагінан-індукованому запаленні суглобу та профілактичному введенні
хондроїтин сульфату.
18
4. Дослідити рівень експресії генів у крові, залучених у розвиток
запалення, при каррагінан-індукованому запаленні суглобу та профілактичному
введенні хондроїтин сульфату.
Об’єкт дослідження: біохімічні механізми розвитку запалення в організмі
щурів з експериментальним каррагінан-індукованим запаленням суглобу та
відновлювальні процеси при профілактичній дії хондропротектора.
Предмет дослідження: маркери запалення, стан окисно-антиоксидантної
системи, рівень експресії мРНК генів, залучених у розвиток запалення у щурів за
умов каррагінан-індукованого запалення суглобу та при профілактичному
введенні хондроїтин сульфату і його протизапальні, імуномодулюючі та
антиоксидантні властивості.
Методи дослідження: гістологічні, імуноферментні – визначення вмісту
цитокінів, спектрофотометричні – визначення молекул низької молекулярної
маси, вмісту супероксидного радикалу, пероксиду водню, продуктів перекисного
окиснення ліпідів та окисної модифікації білків, каталазної,
супероксиддизмутазної, глутатіонпероксидазної, глутатіонтрансферазної і
глутатіонредуктазної активності, тіолових (SH-) груп; спектрофлюорометричні –
визначення вмісту шиффових основ, відновленого та окисненого глутатіону;
молекулярно-біологічні – ПЛР-аналіз експресії генів циклооксигенази (Ptgs2),
індуцибельної нітрооксидсинтази (Nos2), трансформуючого фактора росту бета
(Tgfb1), транскрипційного фактору NF-κB (Nfkb1) та методи математичної
статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено
дослідження профілактичної дії хондропротекторного препарату – хондроїтин
сульфату на біохімічні показники крові щурів при експериментальному запаленні
суглобу. Показано взаємозв’язок запалення з процесами вільнорадикального
окиснення та функціонуванням системи антиоксидантного захисту у сироватці
крові щурів на моделі каррагінан-індукованого запалення суглобу та при
профілактичному введенні хондропротектора.
19
Виявлено, що при каррагінан-індукованому запаленні суглобу у крові
активується імуноцитокінова система: зростає рівень прозапальних цитокінів:
інтерлейкіну (ІЛ) ІЛ-1β, ІЛ-12В р40, фактору некрозу пухлин-α (ФНП-α), що
супроводжується збільшенням концентрації С-реактивного білка та вмісту
молекул середньої молекулярної маси, які є індикатором розвитку ендогенної
інтоксикації та проявом прогресії запалення. За даних експериментальних умов
рівень антизапальних цитокінів (ІЛ-4, ІЛ-10) залишається незміненим. Доведено
збільшення рівня експресії генів, що залучені до розвитку запалення (Ptgs2, Nos2,
Tgfb1, Nfkb1) у крові щурів за умов каррагінан-індукованого запалення суглобу.
При профілактичному введенні хондроїтин сульфату щурам з гострим запаленням
суглобу у крові досліджувані показники відновлюються, при цьому рівень
антизапального цитокіну ІЛ-10 зростає порівняно з групою тварин з
експериментальним запаленням.
При каррагінан-індукованому запаленні суглобу у крові щурів показано
зсув окисно-антиоксидантної рівноваги в напрямку інтенсифікації
прооксидантних процесів та розвитку окисного стресу на фоні порушення роботи
антиоксидантної системи. Зокрема, у сироватці крові при каррагінаніндукованому запаленні суглобу зростає вміст супероксидного радикалу,
пероксиду водню, підвищується вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів
(дієнових кон’югатів, ТБК-активних сполук, шиффових основ) та збільшується
рівень продуктів окисної модифікації білків (альдо- і кетопохідних нейтрального
та основного характеру). Встановлено, що при експериментальному запаленні
суглобу у сироватці крові знижується супероксиддисмутазна та зростає каталазна
активність порівняно з контролем. За даних експериментальних умов у сироватці
крові знижуються глутатіонпероксидазна, глутатіонредуктазна активності та
вміст відновленого глутатіону, при цьому зростає глутатіонтрансферазна
активність та вміст окисненого глутатіону відносно контрольних значень. При
профілактичному введенні хондроїтин сульфату щурам з гострим запаленням
20
суглобу у сироватці крові відновлюється окисно-антиоксидантний гомеостаз
порівняно з групою тварин з каррагінан-індукованим запаленням.
Розширено наукові дані про особливості профілактичної дії
хондропротекторного препарату на основі хондроїтин сульфату
(імуномодулюючи, антизапальні та антиоксидантні властивості) на розвиток
запалення в організмі щурів при каррагінан-індукованому запаленні суглобу.
Практичне значення одержаних результатів. Експериментально
доведено ефективність профілактичного застосування хондропротекторного
препарату на основі хондроїтин сульфату для зниження запалення суглобу,
викликаного каррагінаном. Результати дисертації можуть бути використані у
профілактичній медицині, практичній травматології і ортопедії та у навчальному
процесі під час підготовки студентів біологічних та медичних спеціальностей.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено пошук та
опрацювання фахової літератури за темою дослідження, аналіз сучасного стану
проблеми, проведення експериментів, обробка, статистичне та теоретичне
обґрунтування результатів дослідження. Формування ідеї та мети роботи,
постановка завдань, моделювання експерименту, планування методичних
підходів, узагальнення результатів дослідження та редагування дисертаційної
роботи здійснено спільно з науковим керівником. Автор висловлює глибоку
вдячність д.б.н., проф. Л.І. Остапченко та д.б.н., проф. Т.В. Береговій з ННЦ
«Інститут біології та медицини» Київського національного університету імені
Тараса Шевченка за консультативну допомогу в проведенні даних досліджень. Всі
дані, отримані у співавторстві, відображені у спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення
дисертаційної роботи були представлені на XI Парнасівський конференції -
Форумі молодих учених "Біохімія та молекулярна біологія для інноваційної
медицини" (Київ, Україна, 2018), XVII міжнародній науковій конференції
«Шевченківська весна: досягнення біологічної науки / BioScience Advances»
(Київ, Україна, 2019), міжнародній науково-практичній конференції-школі
21
студентів та молодих вчених «BIOMED Тalks – 2019» (Київ, Україна, 2019), XII
українському біохімічному конгресі (Тернопіль, Україна, 2019) та XVIII
міжнародній науковій конференції «Шевченківська весна: досягнення біологічної
науки / BioScience Advances» (Київ, Україна, 2020).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових праць, з яких 4
наукові статті у фахових виданнях, що входять до переліку, затвердженому МОН
України, одна стаття у виданні, що входить до міжнародної наукометричної бази
Scopus, а також 5 матеріалів і тез доповідей на всеукраїнських та міжнародних
наукових конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі
вступу, огляду літератури, опису результатів власних досліджень та їх
обговорення, розділу з узагальнення отриманих результатів, висновків, списку
використаних джерел, що включає 251 найменування та додаток. Дисертаційна
робота викладена на 162 сторінках машинописного тексту (з яких основна
частина займає 133 сторінки), ілюстрована 26 рисунками та містить 3 таблиці.
Висновок біоетичної експертизи. Згідно висновку комісії з питань
біоетики Навчально-наукового центру "Інститут біології та медицини" Київського
національного університету імені Тараса Шевченка від 14 січня 2020 року,
експериментальні дослідження вважати такими, що не суперечать
загальноприйнятим біоетичним нормам, виконані з дотриманням відповідних
міжнародних положень стосовно проведення експериментальних робіт та
клінічних досліджень і можуть бути використані в матеріалах дисертації.

Список литературы

ВИСНОВКИ
Дисертаційна робота була присвячена оцінці стану певних показників
запалення в крові щурів за умов розвитку експериментального запалення суглобу та
при профілактичному введенні хондроїтин сульфату. Встановлено, що введення
хондроїтин сульфату щурам знижує розвиток запалення у м’яких тканинах суглобу
(зменшення набряку, зниження лейкоцитарної інфільтрації тканин) та зниження в
крові прозапальних цитокінів (ІЛ-1β, ІЛ-12В р40, ФНП-α), С-реактивного білка,
молекул середньої молекулярної маси, рівня експресії генів, що залучені до
розвитку запалення (Ptgs2, Nos2, Tgfb1, Nfkb1) та збільшення рівня
антизапального цитокіну ІЛ-10.
1. Показано, що за умов карагінан-індуковагого запалення суглобу на
гістологічному рівні виявлена запальна реакція в м’яких тканинах суглобу, при цьому у
сироватці крові зростала концентрація С-реактивного білка, молекул середньої
молекулярної маси, ІЛ-1β, ІЛ-12В р40, ФНП-α, у той час як рівень ІЛ-4, ІЛ-10 не
змінювався. Профілактичне введення хондроїтин сульфату тваринам з запаленням
суглобу призводило до зниження концентрації С-реактивного білка – в 1,4 рази,
молекул середньої молекулярної маси, ІЛ-1β та ІЛ-12В р40 – в 1,3 рази, ФНП-α –
в 1,6 рази на фоні підвищення протизапального ІЛ-10 відносно групи тварин з
експериментальним запаленням.
2. Встановлено, що за умов карагінан-індуковагого запалення суглобу у
сироватці крові підвищувався вміст активних форм кисню, продуктів окиснення
ліпідів та білків відносно контролю. Профілактичне введення хондроїтин
сульфату тваринам з запаленням суглобу призводило до зниження вмісту
супероксидного радикалу – в 1,4 рази, гідроген пероксиду – в 1,3 рази та продуктів
окиснення ліпідів та білків відносно групи тварин з експериментальним
запаленням.
3. Виявлено, що за умов карагінан-індуковагого запалення суглобу у сироватці
крові активність супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази
знижувалася, у той час як вміст відновленого глутатіону та активність каталази,
глутатіонтрансферази і вміст окисненого глутатіону зростала порівняно з
контролем. Профілактичне введення хондроїтин сульфату тваринам з запаленням
суглобу сприяло підвищенню активності супероксиддисмутази – в 1,2 рази,
глутатіонпероксидази – в 1,4 рази, глутатіонредуктази – в 1,3 рази, вмісту
відновленого глутатіону – в 1,5 рази та знижувало активність каталази,
133
глутатіонтрансферази – в 1,3 рази та вміст окисненого глутатіону – в 1,2 рази
відносно групи тварин з експериментальним запаленням.
4. Показано, що за умов карагінан-індуковагого запалення суглобу у крові
зростав рівень експресії прозапальних генів (Ptgs2, Nos, Tgfb1, Nfkb1) порівняно з
контролем. Профілактичне введення хондроїтин сульфату тваринам з запаленням
суглобу призводило до зниження рівня експресії Ptgs2 – в 1,3 рази, Nos2 та Tgfb1
– в 1,2 рази та Nfkb1 – в 1,4 рази відносно групи тварин з експериментальним
запаленням.