Бытяк Денис Сергеевич. Разработка биотехнологии рекомбинантной фосфолипазы А2 Komagataella phaffii

Краткое описание

Бытяк Денис Сергеевич. Разработка биотехнологии рекомбинантной фосфолипазы А2 Komagataella phaffii;[Место защиты: ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»], 2023

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНЖЕНЕРНЫХ
ТЕХНОЛОГИЙ
Бытяк Денис Сергеевич
РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ
ФОСФОЛИПАЗЫ А2 KOMAGATAELLA PHAFFII
2.1 А Биотехнологии пищевых продуктов, лекарственных и биологически
активных веществ
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор Корнеева Ольга Сергеевна
Воронеж 2023
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Классификация и свойства фосфолипаз 10
1.2. Специфичность фосфолипазы А2 и ее применение 20
1.3. Синтез фосфолипазы А2 23
1.4. Перспективные платформы для экспрессии рекомбинантных белков 26
1.5. Дрожжевые экспрессионные системы 27
1.6. Komagataella phaffii - как экспрессионная система 28
1.7. Метаболизм метанола в клетках Komagataella phaffii 31
1.8. Особенности культивирования Komagataella phaffii 33
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
2.1. Материалы 38
2.2. Методы исследований 41
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ФОСФОЛИПАЗЫ А2 60
3.1. Получение ауксотрофного штамма Komagataella phaffii YIB-Aleu2 60
3.2. Получение штамма-продуцента фосфолипазы А2 на основе ауксотрофного
штамма Komagataella phaffii YIB Aleu2 64
3.3. Молекулярно-генетическое исследование штамма-продуцента 68
3.4. Исследование морфологических характеристик штамма-продуцента 70
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ_А2 72
4.1. Повышение растворимости питательной среды BSM 72
4.2. Исследование влияние кукурузного экстракта на прирост биомассы 74
4.3. Определение оптимальных параметров ведения культивирования
Komagataella phaffii YIB Aley2_PLA2Sv 75
4.4. Исследование удельной скорости роста и потребления глицерина 81
4.5. Разработка стратегии индукции AOX1-промотора 84
4.6. Оценка селективности керамических фильтров 89
4.7. Определение оптимальной степени концентрирования 96
4.8. Восстановление фильтрующей способности фильтров 98
4.9. Удаление ДНК штамма-продуцента 102
4.10. Схема получения фосфолипазы А2 106
ГЛАВА 5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА «ФОСФОЛИПАЗА А2» И ПРАТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ 109
5.1. Исследование влияния pH на ферментативную активность 109
5.2. Исследование условий инактивации ферментативной активности 110
5.3. Исследование влияния температуры на активность фосфолипазы А2 112
5.4. Исследование стабильности ферментного препарата «Фосфолипаза А2» в
процессе хранения 114
5.5. Практическое применение полученного ферментного препарата
«Фосфолипаза А2» 116
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 120
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 122
ПРИЛОЖЕНИЯ 137

Список литературы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате выполнения настоящего диссертационного исследования, на основании экспериментальных данных и данных, полученных методом математического моделирования, созданы научно-практические подходы получения ферментного препарата, обладающего фосфолипазной активностью и разработана технология получения ферментного препарата «Фосфолипаза А2».
1. Получен ауксотрофный штамм Komagataella phaffii YIB-Aleu2 не способный к росту на питательной среде без лейцина, на основе штамма-реципиента Komagataella phaffii Y-3489. Полученный штамм депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) под номером Y-4761 и может использоваться в качестве штамма-реципиента.
2. Разработан новый, генно-инженерно-модифицированный штамм-продуцент рекомбинантного белка PLA2, на основе ауксотрофного штамма Komagataella phaffii YIB-Aleu2, обеспечивающий экспрессию целевого белка в культуральную жидкость. Полученный штамм-продуцент депонирован в БРЦ ВКПМ под номером Y-4513.
3. Установлено, что разработанный штамм Komagataella phaffii YIB-Aleu2, при культивировании на модифицированной питательной среде BSM, при pH 6,2 ±0,1, температуре 29,6 ±0,4 и количестве инокулята от 5 % до 10 %, способен синтезировать фосфолипазу А2 с удельной активностью 2 093 ±52 ед/мг.
4. Установлено, что при культивировании штамм Komagataella phaffii YIB- Aleu2 на питательной среде, содержащей метанол в количестве от 0,6 до 2 %, обеспечивается индукция AOX1-промотора и экспрессия не менее 1,87 г/л рекомбинантного белка PLA2 за 96 ч.
5. Получен ферментный препарат, на основе штамма-продуцента, обладающий фосфолиполитической активностью 17 979 ед/мл.
6. Показано, что при значениях pH субстрата 8,5 и температуре 55 °С, фосфолипаза А2 обладает наибольшей ферментативной активностью. Также установлено, что полное подавление активности фермента достигается при 67,37 °С и времени экспозиции 56 минут. Продемонстрировано, что через 12 месяцев хранения ферментного препарата, активность составляет более 10 500 ед/мл.
7. Показано, что опытная партия пищевой продукции, полученная с применением разработанного ферментного препарата фосфолипазы А2 соответствует требованиям ГОСТ.
Таким образом в результате выполнения диссертационной работы решены все задачи, стоящие перед исследованием, а цель - достигнута.
В качестве рекомендаций по применению результатов диссертации предлагается использовать разработанный штамм-продуцент и разработанный технологический процесс, при организации промышленного производства ферментного препарата «Фосфолипаза А2», в коммерческих интересах. Перспективы дальнейшей разработки темы состоят в:
1. Продолжении изучения ферментативного катализа полученного рекомбинантного белка фосфолипазы А2, по отношению к различным субстратам, содержащим в своем составе фосфолипиды, в частности лецитины.
2. Более детальном изучении особенностей масштабирования разработанной технологии получения ферментного препарата «Фосфолипаза А2».
3. Продолжении исследования различных характеристик технологического процесса, с целью снижения потерь целевого продукта при организации производства.