Ген альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens как модель для конструирования секреторных векторов Сорокин, Алексей Васильевич

Краткое описание

Сорокин,АлексейВасильевич.Генальфа-амилазыBacillusamyloliquefaciensкакмодельдляконструированиясекреторныхвекторов: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 1985. - 100 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
ЖСТЙГУТ ГЕЬЕТШл И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫПШЕННЫ}^ 1#КР00РГА1ШМ0В па правах рукописиСОРОКИНАЛЕКСЕИВАа-ШЬЕВИЧ УД1{ 579.852.11:576.5:579.842.11ГЕНAJIbSA-ALIMiGK ЫсШ^ C ^ ^ - % ^ C < W < LКАКМаДЕЛЬДЛЯКОНСТРУ^ТРОВАНШСЕКРЕТОРНЫХВЕКТОРОВ. 03.00.03 - 1,10лекз^Л5грная биология Научный руководитель: доктор биологическюс

стр. 4
конструированиена основе этогогенасекреторноговектораи экспрессия человечес­ кого интерферона с помощью этоговектора.Одновременно была поставлена задача изучения структурыгенаd. -ами­ лазыи сравнения структуры клонированногогенасгеномЫ- -амилазыиз штаюла в. aAv^^^-^^-f^^^^cU^-^ EI8 /95/. Научная

стр. 5
вектор,с помощью которого получена экспрес­ сия оС-2 интерферона человека в клетках ^. <^<^^ Полученныйсекреторныйвекторпредставляет собою осно­ вудляконструированиясекреторныхвекторовдлядругих орга­ низмов. Знание первичной и вторичной структуры </-амилазыпозволяет проводить планирование и

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Сорокин, Алексей Васильевич
Клонирование генов d -амилаз из ScxcuMU^o.
Большой интерес к секреторным ферментам бадшш,развитие систем клонирования генов в а также относительная простота тестирования работы гена ¿¿-амилазы,предопределили быстрый прогресс в клонировании генов -амилаз из различных бацилл.В настоящее время известно о выделении
• • О О I путем клонирования по-краинеи мере восьми генов -амилаз из .Наибольшее количество работ посвящено клонированию осахаривающей «¿-амилазы из /94,117,
118/.Во всех этих работах предпринималось изучение нуклео-тидной последовательности клонированного гена.Было обнаружено, что все клонированные гены сильно гомологичны и различаются лишь единичными заменами.Было также установлено,что экспрессия гена в £ приводит к структурной нестабильности несущих его плазмид /6,118/.Интересно также,что в двух случаях ген не содержал последовательности,кодирующей довольно большой С-концевой сегмент белка,но тем не менее, наблюдался синтез активного продукта /6,94/.Установлены изменения в промоторной части гена,приводящие к сверхпродукции Ы. -амилазы в ß. a^UUí^l /117/.Две серии работ /24, 102,113/ были посвящены экспрессии генов термостабильных oi -амилаз в клетках ¿сс^^с^л #это относится к ot -амилазам из tf. «h^^V24/ и из g fz&l&z/Ю2/.Показано,что в обоих случаях ¿¿-амилаза является периплазматическим белком .в случае «-амилазы из ся^рЛя^ч. наблюдалась структурная нестабильность плазмид, и было показано,что экспрессия гена ухудшает рост клеток на средах,содержащих в качестве источника углерода мальтозу или глицерин /ИЗ/.Были отобраны мутанты j для которых не наблюдалось такого ухудшения роста.В случае oL -амилазы из плазмидной нестабильности и угнетения роста бактерий не было обнаружено /102/.
Палва и др./78/ клонировали ген ¿-амилазы из В.ал^с- , EI8 с целью конструирования секреторного вектора для ß. и изучения секреции чужеродных белков из клеток й. .Удовлетворительный результат применения такой системы для экспрессии чужеродного гена был получен только для гена другой термостабильной -амилазы - из б*.-^j/jiH^ViW^ /76/.Из личного сообщения К.Лунд-стрема,сделанного им во время конференции ФЕБО в Москве в 1984 г.известно,что при слиянии регуляторной области, включающей сигнальный пептид d -амилазы ~ со структурной частью гена oi -амилазы из уА^ ,в клетках G. наблюдался синтез и секреция oL -амилазы в.^с/^^^и достигающий 50% от синтеза сА -амилазы 6. .Таким образом,показано, что секреция этих белков в л^U-MXi^ происходит по одинаковым механизмам.
Энзиматические свойства с<-амилаз.
При кратком обсуждении свойств амилаз как ферментов, остановимся на следующих вопросах: а)классификация амилаз; б)величина ¿с** и для амилаз; в)аминокислоты, участвующие в катализе; г)механизм связывания фермента с полимерным субстратом и распределение продуктов реакции.
На Рис.8 изображена цепь крахмала.Звенья глюкозы, соединённые <>¿-1-4 связями,называются амилозой, звенья, соединённые связями 1-6, называются пектином. оС-амилазы-это ферменты,осуществляющие разрыв связи 1-4.
В связи с таким определением,можно представить себе несколько типов (/-амилаз.Во-первых,это ферменты, осуществляющие гликолитиче о кую атаку,т.е. разрезающие субстрат изнутри.Такие амилазы называются эндоамилазами. К ним,в частности, относятся амилазы вах^^^ и ^с^^рп^^ /50/.Среди эндо-амилаз можно выделить разжижающие и осахаривающие /82/.Эти два типа ¿¿-амилаз различаются размерами образуемых продуктов реакции - у ¿¿-амилаз разжижающего типа более полимерные продукты.Такое различие -амилаз по распределению размеров продуктов связано с различием в механизме связывания полимерного субстрата,что будет обсуждаться несколько ниже.