Генно-клеточные технологии для коррекции патогенетических процессов при боковом амиотрофическом склерозе Салафутдинов Ильнур Ильдусович

Краткое описание

Салафутдинов,ИльнурИльдусович.Генно-клеточныетехнологиидлякоррекциипатогенетическихпроцессовприбоковомамиотрофическомсклерозе: диссертация ... доктора биологических наук : 03.01.04 ; 14.03.03 /СалафутдиновИльнурИльдусович; [Место защиты: ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»]. - Казань, 2022. - 344 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» На правах рукописиСалафутдиновИльнурИльдусовичГЕННО-КЛЕТОЧНЫЕТЕХНОЛОГИИДЛЯКОРРЕКЦИИПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХПРОЦЕССОВПРИБОКОВОМАМИОТРОФИЧЕСКОМСКЛЕРОЗЕ03.01.04 биохимия 14.03.03

стр. 13
воздействовать на различные патофизиологическиепроцессыприНДЗ. C цельюкоррекцииНДЗ, помимо прямой доставки с использованием генетических конструкций (геннаятерапия in vivo), активно разрабатываются подходы с использованиемклеточныхносителей (генно-клеточнаяиликлеточно-опосредованнаягенная

стр. 15
ими ростовых факторов [271, 426]. Таким образом,длярешения имеющихся фундаментальных и прикладных задач необходимо комплексное исследование патофизиологическихпроцессовприБАС с целью разработки таргетныхгенныхигенно-клеточныхсистемдлясдерживания гибели мотонейронов и стимулирования нейрорегенерации.

Оглавление диссертациидоктор наук Салафутдинов Ильнур Ильдусович
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. OБЗOP ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Нейродегенеративные заболевания
1.1.1 Боковой амиотрофический склероз
1.1.2 Моделирование бокового амиотрофического склероза
1.2 Факторы нейропластичности, стимуляторы нервных клеток
1.2.1 Нейротрофические факторы
1.2.2 Факторы роста
1.2.3 Молекулы клеточной адгезии
1.3 Вирусные вектора для доставки рекомбинантных генов
1.3.1 Аденовирусные вектора
1.3.2 Адено-ассоциированные вектора
1.3.3 Вектора на основе вируса простого герпеса
1.3.4 Лентивирусные вектора
1.4 Невирусные системы. Плазмидные вектора
1.5 Стратегии ко-экспрессии рекомбинантных белков генетическими векторами
1.5.1 Сайты внутренней посадки рибосом
1.5.2 Системы двунаправленных промоторов
1.5.3 Саморасщепляющиеся пептидные последовательности
1.6 Генная терапия нейродегенеративных заболеваний
1.7 Клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний
1.7.1 Эмбриональные стволовые клетки
1.7.2 Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
1.7.3 Мезенхимные стволовые клетки
1.7.4 Клетки пуповинной крови человека
1.8 Клеточно-опосредованная генная терапия нейродегенеративных
заболеваний
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Получение рекомбинантных аденовирусов
2.1.1 Полимеразная цепная реакция
2.1.2 Клонирование кДНК продуктов амплификации в плазмидный вектор рЕОТКЮ-ТОРО
2.1.3 Клонирование кДНК продуктов амплификации в плазмидный вектор рБОКИ221
2.1.4 Рекомбинация целевых генов в плазмидный вектор pAd/CMV/V5-Dest
2.1.5 Электрофорез в агарозном геле
2.1.6 Очистка продуктов ПЦР реакции
2.1.7 Выделение плазмидной дезоксирибонуклеиновой кислоты
2.1.8 Определение первичной нуклеотидной последовательности ДНК
2.1.9 Наработка рекомбинантных аденовирусов
2.2 Методы работы с прокариотическими клетками
2.2.1 Бактериальные штаммы
2.2.2 Трансформация бактериальных клеток
2.3 Методы работы с эукариотическими клетками
2.3.1 Клеточные типы, культивирование
2.3.2 Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки мишени
2.3.3 Анализ эффективности трансфекции клеток
2.4 Методы исследования экспрессии генов
2.4.1 Выделение рибонуклеиновых кислот из клеточных культур
2.4.2 Реакция обратной транскрипции
2.4.3 Количественная оценка экспрессии мРНК генов
2.5 Методы анализа экспрессии белков in vitro
2.5.1 Иммуноцитохимический анализ
2.5.2 Иммуноблоттинг
2.5.3 Иммуноферментный анализ
2.5.4 Мультиплексный анализ
2.5.5 Двумерный гель-электрофорез
2.6 Трансмиссионная электронная микроскопия
2.6.1 Микроскопия рекомбинантных аденовирусов
2.6.2 Микроскопия генетически модифицированных клеток и тканей
2.7 Протеомное профилирование рекомбинантных аденовирусов
2.8 Таргетное метаболомное профилирование
2.9 Транскриптомное профилирование генетически модифицированных клеток
2.10 Опыты на животных моделях
2.10.1 Исследование иммуногенности 2А-пептидных препаратов
2.10.2 Получение антител к 2А-пептиду
2.10.3 Исследование проангиогенных свойств модифицированных клеток in vivo
2.10.4 Трансгенные SOD1-G93A мыши с фенотипом бокового
амиотрофического склероза
2.11. Иммуногистохимические методы
2.11.1 Подготовка образцов тканей для иммуногистохимического исследования
2.11.2 Иммуногистохимические исследования
2.11.3 Морфометрические исследования
2.12 Функциональные тесты
2.12.1 Клиническая оценка патофизиологического состояния подопытных животных
2.13 Программное обеспечение и статистическая обработка результатов ... 140 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Создание и характеризация рекомбинантных аденовирусов
3.1.1 Конструирование рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, экспрессирующих гены проангиогенных, нейротрофических факторов и молекулы клеточной адгезии
3.1.1.1 Амплификация кДНК SDF1, GFP, NCAM1, GDNF и VEGF165
3.1.1.2 Амплификация кДНК VEGF165-FuP2A-FGF2
3.1.1.3 Клонирование кДНК VEGF165 и GDNF в pENTR-D/TOPO
3.1.1.4 Клонирование кДНК FGF2, SDF1, NCAM1 и VEGF165-FuP2A-FGF2 в pDONR221
3.1.1.5 Рекомбинация кДНК VEGF, GDNF FGF2, SDF1, NCAM1, VEGF165-FuP2A-FGF2 в экспрессионный аденовирусный вектор
3.1.2 Исследование экспрессии рекомбинантных белков аденовирусными плазмидными конструкциями
3.1.3 Наработка и титрование рекомбинантных аденовирусов
3.1.4 Трансмиссионная электронная микроскопия синтезированных аденовирусных частиц
3.1.5 Протеомное профилирование синтезированных аденовирусных частиц
3.2 Характеристика мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами
3.2.1 Экспрессия рекомбинантных генов генетически модифицированными мононуклеарными клетками крови пуповины человека
3.2.1.1 Экспрессия GFP генетически модифицированными мононуклеарными клетками крови пуповины человека in vitro
3.2.1.2 Экспрессия рекомбинантных терапевтических генов модифицированными мононуклеарными клетками крови пуповины человека in vitro
3.2.2 Транскриптомное профилирование мононуклеарных клеток крови пуповины человека модифицированных Ad5-VEGF165
3.2.3 Секретомное профилирование мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных Ad5-VEGF165
3.2.4 Протеомное профилирование мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных Ad5-VEGF165
3.2.5 Одновременная экспрессии VEGF и FGF2 мононуклеарными клетками крови пуповины человека, модифицированных Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2 .. 175 3.2.5.1 Оценка иммуногенных свойств рекомбинантных белков VEGF165 и FGF2 в составе аденовирусной конструкции Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2 in vivo
3.2.6 Ко-экспрессия трансгенов мононуклеарными клетками крови пуповины человека, одновременно модифицированных двумя аденовирусами
3.2.7 Ко-экспрессии трансгенов мононуклеарными клетками крови пуповины человека, модифицированных тремя аденовирусами
3.2.7.1 Иммунофенотипическая характеристика мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных тремя аденовирусами
3.2.7.2 Ультраструктурный анализ мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных тремя аденовирусами
3.2.7.3 Цитокиновое профилирование мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных тремя аденовирусами
3.2.7.4 Влияние трансплантированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных тремя аденовирусами, на ангиогенез in vivo
3.3 Патоморфологические изменения у трансгенных SOD1-G93A мышей на фоне прогрессирования заболевания
3.3.1 Динамика изменений количества миелиновых волокон седалищного нерва на фоне прогрессирования заболевания у трансгенных SOD1 -G93A мышей
3.3.2 Трансмиссионная электронная микроскопия седалищного нерва на фоне прогрессирования заболевания у трансгенных SOD1-G93A мышей
3.3.3 Трансмиссионная электронная микроскопия спинного мозга трансгенных SOD1-G93A мышей на фоне прогрессирования заболевания
3.4 Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека трансгенным животным c фенотипом
бокового амиотрофического склероза
3.4.1 Иммунотолерантность трансплантированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека
3.4.2 Фенотипирование мононуклеарных клеток пуповинной крови человека после трансплантации мышам c фенотипом бокового амиотрофического склероза
3.4.3 Экспрессия каспазы-3 в мотонейронах спинного мозга SOD1-G93A мышей
3.4.4 Экспрессия GFP трансплантированными мононуклеарными клетками крови пуповины человека в спинном мозге SOD1-G93A мышей
3.4.5 Экспрессия рекомбинантных терапевтических белков мононуклеарными клетками крови пуповины человека в спинном мозге SOD1-G93A мышей
3.4.5.1 Модификация мононуклеарных клеток крови пуповины человека Ad5-VEGF-p2aFu-FGF2
3.4.5.2 Модификация мононуклеарных клеток крови пуповины человека одним аденовирусом
3.4.5.3 Модификация мононуклеарных клеток крови пуповины двумя аденовирусами
3.4.5.4 Модификация мононуклеарных клеток крови пуповины тремя аденовирусами
3.4.6 Миграция генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека в спинном мозге трансгенных SOD1 -G93A мышей

3.4.6.1 Распределение модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека в спинном мозге трансгенных SOD1-G93A мышей
3.5 Влияние трансплантированных генетически модифицированных мононуклеарных клеток человека на поведенческие реакции и выживаемость трансгенных SOD1-G93A мышей
3.6 Динамика изменений уровней хемокинов на фоне прогрессии бокового амиотрофического склероза и проводимой терапии у трансгенных SOD1-G93A мышей
3.7 Динамика изменений уровней метаболитов на фоне прогрессии бокового амиотрофического склероза и проводимой терапии у трансгенных SOD1
G93A мышей
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ