Гомологическая рекомбинация у эукариот: Особенности гомологических ДНК-трансфераз RAD51 из дрожжей Pichia angusta и водорослей Chlamydomonas reinhardtii Шалгуев, Валерий Иванович

Краткое описание

Шалгуев,ВалерийИванович.Гомологическаярекомбинацияуэукариот:ОсобенностигомологическихДНК-трансферазRAD51издрожжейPichiaangustaиводорослейChlamydomonasreinhardtii: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Санкт-Петербург, 2006. - 122 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
61:07-3/154 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ им. Б.П. КОНСТАНТИНОВА На правах рукописиШАЛГУЕВВалерийИвановичГОМОЛОГИЧЕСКАЯРЕКОМБИНАЦИЯУЭУКАРИОТ:ОСОБЕННОСТИГОМОЛОГИЧЕСКИХДНК-ТРАНСФЕР A3RAD51ИЗДРОЖЖЕЙPichiaangustaИВОДОРОСЛЕЙChlamydomonasreinhardtii03.00.03 -молекулярная биология Диссертапия на соискание ученой степени кандидата...

стр. 59
E I 154 124 \H IIVRad51.,.t I'a I Рис. 3-2. Диаграмма областей аминокислотной гомологии между дрожжевымиRad51-подобными белками. Обозначения:Rad51Р - /*.angustaRad51;Rad51sp- S. pombeRad51; Rad5 lsc - •- cerevisiaeRad51;Rad51HS а 5 H. sapiensRad51; ЯесАнс - E. coli RecA. N-terminus - N-концевой

стр. 59
Dmcl^ Rad51p. Рис. 3-3. Филогенетическое древо сравнения аминокислотных последовательностейRad51из Р.angustaи других белковRad51/RecA. Обозначения: R a d 5 h ^ - P .angustaRad51;Rad51sp- S. pombeRad51; Rad5sc-S. cerevisiaeRad51;Rad51HS - Я sapiensRad51;Rad51нт - Mus musculusRad51;Rad51

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Шалгуев, Валерий Иванович
Введение .- 5
Список сокращений.-11
Глава 1. Обзор литературы.-14
1.1. Введение.-141.2. Гомологическая рекомбинация у прокариот.-14
1.2.1. Схема гомологической рекомбинации.-15
1.2.2. Биохимические свойства белка RecA у бактерий.-171.2,3. Пространственная структура белка RecA.- 20
1.3. Гомологическая рекомбинация у эукариот.- 22
1.3.1. Схема гомологической рекомбинации у дрожжей S. cerevisiae.- 23
1.3.2. Три субсемейства белков ГР у дрожжей S. cerevisiae.- 23
1.3.3. Биохимические свойства белка Rad51 So.- 25
1.3.4. Схема гомологической рекомбинации у Н. sapiens.- 28
1.3.5. Консервативность нуклеопротеиновых филаментов RecAEc, Rad51Hs и Rad51Sc.- 32
1.4. Дрожжи P. angusta как объект исследований.- 33
1.5. Водоросли С. reinhardtii как объект исследований.- 34
1.6. Задачи данного исследования.- 34
Глава 2. Материалы и методы.- 36
2.1. Бактериальные и дрожжевые штаммы.- 36
2.2. Приборы и оборудование.-362.3. Ферменты и реактивы.- 36
2.3.1. Ферменты.-362.3.2. Среды.-372.4. Плазмиды.- 37
2.4.1. Выделение плазмидной ДНК.- 37
2.4.2. Клонирование и секвенирование генаRAD51 из P. angusta.- 38
2.4.3. Конструирование и секвенирование плазмид.- 38
2.5. Олигонуклеотиды.- 40
2.6. Выделение, визуализация и определение концентрации белков.- 42
2.6.1. Выделение белка Rad51Ра из P. angusta.- 42
2.6.2. Выделение белка Rad51ССг из С. reinhardtii.- 44
2.6.3. Выделение белка Rad5 lCCr-His6 из С. reinhardtii.- 46
2.6.4. Выделение белков RPA и Rad51Sc из S. cerevisiae.- 46
2.6.5. Выделение белка RecAEc из Е. coli.- 46
2.6.6. Визуализация белков методом иммуноблотинга.- 46
2.6.7. Определение концентрации белков.- 46
2.7. Тестирование нуклеазной активности в препаратах белков.
2.7.1. ОнДНК-экзонуклеазный тест.
2.7.2. ДнДНК-экзонукпеазный тест.
2.7.3. ДнДНК-эндонуклеазный тест.
2.7.4. Геликазный тест.
2.8. Анализ кинетических параметров реакции гидролиза АТФ, катализируемого белками Rad51 и RecA.
2.8.1. Гидролиз АТФ.
2.8.2. Кинетические параметры гидролиза АТФ.
2.8.3. Термодинамические параметры активации гидролиза АТФ.
2.8.4. Термодинамические параметры инактивации гидролиза АТФ.
2.9. Тестирование связывания белка Rad51 CCr-His6 с онДНК (молекулярным биконом).
2.10. Рекомбинационный перенос нитей ДНК in vitro.
2.10.1. Реакция переноса нитей с радиоактивномеченной ДНК.
2.10.2. Реакция переноса нитей с субстратом на основе фага фХ174.
2.10.3. Реакция замещения нити с флуоресцентномеченной ДНК.
2.10.4. Анализ кинетических параметров реакции замещения нити ДНК.
2.11. Тестирование функциональной компенсации дефекта гена RAD51 в S. cerevisiae.
2.12. Статистическая обработка результатов.
Глава 3. Исследование рекомбинационных и термодинамических характеристик белков Rad51 из дрожжей Р. augusta и S. cerevisiae.
3.1. Клонирование и первичная структура гена RAD51 из P. angusta.
3.2. Экспрессия и выделение белка Rad51ра из Р. angusta.
3.3. Гидролиз АТФ, катализируемый белком Rad51Ра.
3.3.1. ДНК-зависимая скорость гидролиза АТФ.
3.3.2. Влияние различных субстратов ДНК на АТФазную активность.
3.3.3. Стехиометрия связывания белка Rad51Pa с онДНК.
3.3.4. Стимуляция онДНК-зависимой АТФазной активности белка Rad51 Ра белками
SSB и RPA.
3.3.5. Сравнение термостабильности белков Rad51Pa и Rad51sc.
3.3.6. Термозависимость нуклеации.
3.3.7. Кинетические параметры гидролиза АТФ.
3.3.8. Кооперативность гидролиза АТФ.
3.3.9. Зависимость гидролиза АТФ от рН.
3.4. Рекомбинационный перенос онДНК, активируемый [Rad51Pa::ATP::oHflHK].
3.4.1. Реакция замещения нити ДНК.
3.4.2. Реакция переноса нитей ДНК.
3.5. Анализ функциональной компенсации дефекта гена RAD51 в дрожжах S. cerevisiae.
Глава 4. Изучение рекомбинационных свойств и кинетических параметров белка Rad51C из микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii.
4.1. Выделение белков Rad51CCr и Rad51Ccr-His6 из С. reinhardtii.
4.2. Гидролиз АТФ, катализируемый белками Rad51 ССг и Rad51 CCr-His6.
4.2.1. Температурная зависимость скорости гидролиза АТФ.
4.2.2. Влияние различных субстратов ДНК на АТФазную активность.
4.2.3. Зависимость скорости гидролиза АТФ от рН.
4.2.4. Стехиометрия взаимодействия белка Rad5 lCCr-His6 и поли^Т) в пресинаптическом комплексе.
4.2.5. Стабильность пресинаптического комплекса.
4.3. Анализ кинетики связывания белка Rad5 lCcr-His6 с онДНК (молекулярным биконом).
4.4. Рекомбинационный перенос онДНК in vitro, катализируемый [Rad51 Ccr
His6:: ATP: :онДНК].
4.4.1. Реакция замещения нити ДНК.
4.4.2. Реакция переноса нитей ДНК.
Глава 5. Обсуждение.
5.1. Термальная адаптационная гипотеза.
5.2. Анализ термостабильности белков.
5.3. Связь скорости гидролиза, катализируемого RecA-подобным белком, со сложностью генома и длиной клеточного цикла.
5.4. Биохимические и рекомбинационные характеристики белкаRad51Pa из P. angusta.
5.5. Биохимические и рекомбинационные характеристики белка Rad51С из С. reinhardtii-
Глава 6. Выводы.
Список публикаций по теме диссертации.