Характеристика геномной организации МНС в Oreochromis niloticus Донгак, Роман Шивит-оолович

Краткое описание

Донгак,РоманШивит-оолович.ХарактеристикагеномнойорганизацииМНСвOreochromisniloticus: диссертация ... кандидат биологических наук : 03.00.26 /ДонгакРоманШивит-оолович; [Место защиты: Университет Тюбингена им. Эберхарда Карла (Германия)]. - Тюбинген, 2003. - 161 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
Университет Тюбингена имени Эберхарда Карла 62 12/36 На правах рукописи •о иДонгакРоманШивит-ооловичХАРАКТЕРИСТИКАГЕНОМНОЙОРГАНИЗАЦИИМНСВ ОКЕОСНКОМ18

стр. 2
антигена........................................................................1 2. Структура молекулМНС................................................................................... 4 3. Распознавание антигена и функция молекулМНС......................................... 9 4.ОрганизациягеновМНС...................................................................................11 5.ГеномнаяорганизацияМНС: от млекопитающих до...

стр. 97
^ i ""OreochromisnUoticus AK)35351 Aulonocara hansbaenschi _____ 02S7OreochromisniloticusG2S8Oreochromisnilntinn 96 r G2S3 Ureocnromisniloticus---- Lj ureocnromisniloticusUzalOreochromisniloticusQ ,G1S7 Orenrh romis niloiicus Q 991 AF411639 Xiphophorus hellerii guentheri AF411650 Xiphophorus

Оглавление диссертациикандидат наук Донгак, Роман Шивит-оолович
I. Введение................................................................................................................1
1. Главный комплекс гистосовместимости (МНС): от трансплантации опухолей до презентации антигена........................................................................1
2. Структура молекул МНС....................................................................................4
3. Распознавание антигена и функция молекул МНС..........................................9
4. Организация генов МНС...................................................................................11
5. Геномная организация МНС: от млекопитающих до рыб............................13
6. Полиморфизм и механизмы диверсификации генов МНС...........................14
7. Классификация и географическое распространение циклидов....................23
8. Цели проекта......................................................................................................26
II. Оборудование, материалы и реагенты............................................................28
1. Объект.................................................................................................................28
2. Оборудование....................................................................................................28
3. Материалы..........................................................................................................29
3.1. Наборы...........................................................................................................30
4. Химикаты и реагенты........................................................................................30
4.1 Растворы и буферы........................................................................................31
4.2. Реагенты для полимеразной цепной реакции............................................34
4.3. Антибиотики и ферменты............................................................................34
4.4. Среды.............................................................................................................35
5. Векторы клонирования и бактериальные штаммы........................................36
III. Методы.............................................................................................................39
1. Стандартные методы.........................................................................................39
1.1. Фенол-хлороформная экстракция ДНК......................................................39
1.2. Осаждение ДНК этанолом...........................................................................39
1.3. Осаждение плазмидной ДНК изопропанолом...........................................40
1.4. Горизонтальный гель электрофорез...........................................................40
1.4.1. Разделение низкомолекулярных фрагментов ДНК..............................40
1.4.2. Разделение высокомолекулярных фрагментов ДНК...........................41
1.4.2.1. Гель электрофорез в пульсирующем поле......................................41
1.4.2.2. Длинный гель электрофорез..............................................................41
1.5. Определение содержания ДНК.....................................................................42
1.5.1. Спектрофотометрическое определение содержания ДНК....................42
1.5.2. Определение содержания ДНК с помощью бромида этидия................43
1.6. Центрифугирование.......................................................................................43
2. Ферментные методы..........................................................................................43
2.1. Рестрикция ДНК энзимами..........................................................................43
2.1.1. Рестрикция ВАС клонов Ыой для определения размера ДНК-включения..............................................................................................................43
2.1.2. Рестрикция ВАС клонов эндонуклеазой Тад! для определения числа локусов МНС.........................................................................................................44
2.1.3. Частичная рестрикция ВАС клонов.......................................................44
2.2. Реакции лигации...........................................................................................45
2.2.1. Лигация фрагментов ДНК в вектор рвЕМ-Т Базу.................................45
3. Извлечение ДНК................................................................................................46
3.1. Извлечение фрагментов ДНК из агарозной геля.......................................46
3.2. Извлечение ДНК методом щелочного лизиса...........................................46
3.3. Извлечение ДНК ВАС клонов для секвенирования..................................47
4. Полимеразная цепная реакция.........................................................................47
4.1. Амплификация полимеразной цепной реакцией и праймеры.................47
5. Трансформация бактериальных клеток...........................................................53
5.1. Приготовление химически компетентных клеток бактерий Е.соН.........53
5.2. Трансформация Е.соН штамма Ш 109.......................................................54
6. Перенос фрагментов ДНК................................................................................55
6.1. Капиллярное блоттирование фрагментов ДНК.........................................55
6.2. Точечное блоттирование колонии единственной бактерии.....................56
7. Гибридизация.....................................................................................................56
7.1. Хемилюминесцентная гибридизация.........................................................56
7.1.1. Прегибридизация.....................................................................................56
7.1.2. Гибридизация...........................................................................................57
7.1.3. Промывка после гибридизации..............................................................57
7.1.4. Авторадиография.....................................................................................57
7.2. Радиоактивная гибридизация.....................................................................58
7.2.1. Прегибридизация....................................................................................58
7.2.2. Гибридизация..........................................................................................58
7.2.3. Промывка после гибридизации.............................................................58
8. Зонды для гибридизации..................................................................................59
9. Секвенирование.................................................................................................60
9.1. Приготовление акриламидной гели для электрофореза...........................60
9.2. Реакция секвенирования..............................................................................61
9.2.1. Секвенирование продуктов ПЦР...........................................................61
9.2.2. Секвенирование концевых последовательностей ВАС клонов..........62
10. Праймеры для секвенирования......................................................................62
11. Секвенирование клона All............................................................................63
12. Анализ последовательностей ДНК................................................................63
13. Филогенетический анализ..............................................................................64
IV. Результаты........................................................................................................65
1. Извлечение ВАС клонов, содержащих гены класса I МНС..........................65
2. Извлечение ДНК класс I ВАС клонов и оценка размера ДНК включения..65
3. Число локусов класса I МНС............................................................................66
4. Извлечение ВАС клонов, содержащих класс II гены МНС с помощью
метода точечного блоттирования колонии единственной бактерии.............68
5. Число локусов класса НА и В МНС................................................................69
5.1. Гибридизация с зондами, специфичными к генам класса ПА.................70
5.2. Гибридизация с зондами, специфичными к генам класса ПВ.................71
6. Извлечение последовательностей класса ПВ МНС.......................................72
7. Извлечение последовательностей класса ПА МНС.......................................78
8. Извлечение экзонов 2, 3 и 4 генов класса I МНС...........................................82
9. Филогенетический анализ последовательностей класса I МНС...................88
10. Экспрессия генов МНС...................................................................................94
10.1. Экспрессия генов класса I МНС.................................................................94
10.2. Экспрессия генов класса ПА МНС.............................................................95
10.3. Экспрессия генов класса ПВ МНС.............................................................96
11. Конструкция кластеров клонов класса I МНС.............................................97
12. Геномная организация локусов класса I МНС.............................................98
12.1. Конструкция кластера А............................................................................98
12.2. Идентификация локусов класса I МНС....................................................99
13. Структурные характеристики геномного региона класса I МНС.............102
13.1. Распределение ОС содержания и повторяющихся элементов.............102
14. Рестрикционное картирование локусов класса II МНС............................104
14.1. Конструкция кластера А..........................................................................104
14.1.1. Неполная рестрикция ВАС клона В5..............................................105
14.1.2. Гибридизация с зондами, специфичными к концам ВАС клона
В5..........................................................................................................................106
14.1.3. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам МНС.............107
14.1.4. Гибридизация с зондом В1Бр6............................................................109
14.2. Конструкция кластера В..........................................................................109
14.2.1. Неполная рестрикция клонов ВЗ и В13.............................................110
14.2.2. Гибридизация с зондами, специфичными к концам ВАС клона
ВЗ..........................................................................................................................110
14.2.3. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам DKB, DAB и
DGB......................................................................................................................110
14.2.4. Гибридизация с зондами B14sp6 и B13sp6.......................................111
14.2.5. Гибридизация с зондами, специфичными к концам клона
В13........................................................................................................................113
14.2.6. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам МНС.............114
14.3. Конструкция кластера С..........................................................................114
14.3.1. Рестрикция клонов В14 и В22............................................................115
14.3.2. Гибридизация с зондами, специфичными к концам клона
В14........................................................................................................................115
14.3.3. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам МНС.............115
14.3.4. Гибридизация с зондами В 13sp6 и В1 lsp6.......................................116
14.3.5. Гибридизация с зондами, специфичными к концам клона В22......118
14.3.6. Гибридизация с зондами, специфичными к локусам МНС.............118
14.3.7. Гибридизация с зондами В11 sp6 и В14Т7........................................118
V. Обсуждение.....................................................................................................120
1. Область класса I МНС в О. niloticus..............................................................120
2. Новые линии генов класса IIB МНС в циклидах.........................................121
3. Эволюция генов класса II МНС в О. niloticus...............................................125
VI. Выводы.........................................................................................................127
VII. Приложение..................................................................................................128
VIII. Сокращения.................................................................................................130
IX. Литература.....................................................................................................134