Хлебцов Борис Николаевич. Исследование липосом, иммунных комплексов и биоконъюгантов золотых наночастиц методами оптической спектроскопии и динамического светорассеяния

Краткое описание

Хлебцов Борис Николаевич. Исследование липосом, иммунных комплексов и биоконъюгантов золотых наночастиц методами оптической спектроскопии и динамического светорассеяния : Дис. ... канд. физ.-мат. наук : 03.00.02 : Саратов, 2004 182 c. РГБ ОД, 61:04-1/705

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И
МИКРООРГАНИЗМОВ
На правах рукописи
05201000811
ХЛЕБЦОВ БОРИС НИКОЛАЕВИЧ
ПЛАЗМОННО-РЕЗОНАНСНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ПРИЛОЖЕНИЙ
Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук по специальности 03.01.02 - биофизика
Саратов —2010
ВВЕДЕНИЕ 9
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И ПОСТАНОВКА ЗАДАЧ
ИССЛЕДОВАНИЯ 23
.1 Получение и определение параметров золотых наночастиц 23
.1.1 Коллоидное золото 23
.1.2 Золотые наностержни 28
.1.3 Золотые нанооболочки 32
.1.4 Методы определения геометрических параметров плазмонно-
резонансных наночастиц' 39
.2 Оптические свойства металлических наночастиц 47
.2.1 Диэлектрические функции 48
.2.2 Оптические свойства плазмонно-резонансных частиц:
дипольное приближение 52
.2.3 Строгие методы расчета оптических свойств наночастиц 59
.3. Функционализация наночастиц и биомедицинские
применения 67
.3.1 Общие принципы получения конъюгатов наночастиц с
биомакромолекулами 67
.3.2 Основные направления биологических применений плазмонно-
резонансных наночастиц 70
.3.3 Детектирование биоспецифических взаимодействий,
иммуноанализ 73
.3.4 Визуализация и контрастирование 79
.3.5 Фототермическая терапия 83
.3.6 Адресная доставка антигенов и лекарств, токсичность и
биораспределение наночастиц 88
ГЛАВА 2 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОКОНЪЮГАТОВ ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ 93
2.1 Двухслойная модель биоконъюгатов: изменение экстинкции
и рассеяния при адсорбции биополимера 95
2.1.1 Оптическая модель биоконъюгатов: теоретический анализ 95
2.1.2 Результаты и их обсуждение 100
2.1.3 Оптимизация оптических свойств биоконъюгатов по размеру
частиц 106
2.2 Многослойная модель биоконъюгатов: изменение экстинкции и рассеяния при адсорбции биополимера 110
2.2.1 Теоретический анализ многослойной модели биоконъюгата
коллоидного золота 110
2.2.2 Изменение спектров экстинкции и рассеяния при формировании
первичного и вторичного полимерного слоя. Оптимизация наносенсоров 113
2.3 Экспериментальное исследование адсорбции биополимеров на золотых наночастицах с использованием спектров статического рассеяния и поглощения света и метода динамического светорассеяния 117
2.3.1 Препараты и реактивы. Приготовление конъюгатов 117
2.3.2 Приборы и методики измерений 119
2.3.3 Результаты экспериментов и их обсуждение 122
2.3.4 Неоднородная модель адсорбции желатина на частицах золота127
2.4 Выводы по главе 131
ГЛАВА 3 ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЗОЛОТЫХ И ЗОЛОТО- СЕРЕБРЯНЫХ НАНОСТЕРЖНЕЙ: ЭКСПЕРИМЕНТ И ТЕОРИЯ 133 
3.1 Теоретическое и экспериментальное исследование
деполяризации света, рассеянного золотыми наностержнями134
3.1.1 Теоретическое моделирование спектров деполяризации
плазмонно-резонансных наночастиц 134
3.1.2 Экспериментальное измерение деполяризации света,
рассеянного золотыми наностержнями 141
3.2 Мультипольные плазмонные резонансы в металлических
наностержнях 151
154 159 161
163 165
167
170
173 177 181
3.2.1 Модель и методы расчетов 152
3.2.2 Зависимость мультипольных резонансов от размера и формы
наностержней
3.2.3 Правила мультипольных вкладов
3.2.4 Ориентационная зависимость мультипольных резонансов
3.2.5 Сравнение с экспериментом и результатами моделирования
методом дискретных диполей
3.2.6 Скейлинг мультипольных резонансов
3.2.7 Зависимость положения мультипольных резонансов от
диэлектрической проницаемости окружающей среды
3.3 Синтез и исследование оптических свойств золото- серебряных наностержней
3.3.1 Синтез золотосеребряных наностержней
3.3.2 Характеристика образцов
3.3.3 Результаты эксперимента и обсуждение
3.3.3 Теоретическое моделирование: оценка толщины серебряного
нанослоя по спектральному сдвигу 191 
3.3.4 Спектральная настройка резонансов экстинкции и
деполяризации. 197
3.5 Выводы по главе 199
ГЛАВА 4 СИНТЕЗ И ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЗОЛОТЫХ НАНООБОЛОЧЕК 202
4.1 Определение размера и концентрации силикатных ядер по спектрам рассеяния 203
4.1.1 Принцип построения калибровочных зависимостей для
определения размера и концентрации силикатных наночастиц205
4.1.2 Экспериментальные исследования наночастиц двуокиси
кремния 208
4.2 Спектры резонансного рассеяния суспензий золотых нанооболочек и многослойных металлодиэлектрических структур 215
4.2.1 Модель и методы расчетов спектров резонансного рассеяния
многослойных металлодиэлектрических наночастиц 218
4.2.2 Спектры резонансного рассеяния золотых нанооболочек 223
4.2.3 Полуширина спектров резонансного рассеяния многослойных
МДС 234
4.3 Биосенсорный потенциал золотых нанооболочек: оптимизация геометрических параметров 237
4.3.1 Поляризуемость многослойной сферы 238
4.3.3 Изменение спектров экстинкции и рассеяния золотых
нанооболочек при формировании первичного и вторичного полимерного слоя. 244
4.4 Выводы по главе 250
ГЛАВА 5 КОЛЛЕКТИВНЫЕ ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАНОЧАСТИЦ С ПЛАЗМОННЫМ РЕЗОНАНСОМ 252
5.1 Оптические свойства золотых и серебряных бисфер: дипольный и мультипольный подход 253
5.1.1 Тензор поляризуемости двух взаимодействующих сфер 253
5.1.2 Многочастичное решение Ми 257
5.1.3 Сравнение спектров экстинкции и рассеяния бисфер,
рассчитанных в дипольном и мультипольном приближениях 259
5.2 Оптическое усиление фототермальной терапии с помощью золотых наночастиц и кластеров 267
5.2.1 Модели и методы расчетов 271
5.2.2 Результаты моделирования и обсуждение 273
5.3 Коллективные плазмонные резонансы в монослое наночастиц и нанооболочек 284
5.3.1 Модели и методы расчета 285
5.3.2 Результаты моделирования коллективных плазмонных
резонансов в монослоях частиц 287
5.3.3 Экспериментальное исследование коллективных плазмонных
резонансов в монослоях золотых нанооболочек 297
5.4 Выводы по главе 306
ГЛАВА 6 СЕРЕБРЯНЫЕ НАНОКУБЫ И ЗОЛОТЫЕ НАНОКЛЕТКИ: СИНТЕЗ, ОПТИЧЕСКИЕ И ФОТОТЕРМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 309
6.1 Синтез и характеристика наночастиц 311
6.1.1 Синтез и характеристика серебряных нанокубов 312
6.1.2 Синтез и характеристика золотых наноклеток 318
6.2 Сравнение фототермических свойств золотых наноклеток, наностержней и нанооболочек 324
6.3 Моделирование спектров поглощения и рассеяния для нанокубиков и наноклеток с хаотической ориентацией 327
6.4 Выводы по главе 331
ГЛАВА 7 БИОФИЗИЧЕСКИЕ И БИОМЕДИЦИНСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛУЧЕННЫХ НАНОЧАСТИЦ И РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДИК 332
7.1 Твердофазный иммуноанализ с использованием функционализованных золотых нанооболочек 332
7.1.1 Синтез и характеристика конъюгатов наночастиц 334
7.1.2 Результаты иммуноанализа и обсуждение 339
7.1.3 Теоретическая модель дот-анализа 342
7.2 In vivo применения золотых нанооболочек для лазерной гипертермии, визуализации клеток и контрастирования ОКТ изображений 352
7.2.1 Синтез образцов, характеризация и контроль качества 354
7.2.2 Биоциркуляция и биораспределение наночастиц 359
7.2.3 Индуцированная наночастицами лазерная гипертермия тканей
лабораторных животных 364
7.2.4 Применение золотых нанооболочек в качестве маркеров для
темнопольной микроскопии клеток 368
7.2.5 Увеличение контраста ОКТ изображений с помощью золотых
нанооболочек 373
7.3 Спектротурбидиметрия липосом и иммунных комплексов 381
7.3.1 Теория спектротурбидиметрического метода определения
размера и параметров структуры липосом и иммунных комплексов 383
7.3.2 Расчет калибровок для определения диаметра частиц, толщины
липосомальной оболочки и состава иммунных комплексов по измерениям волнового экспонента и удельной мутности 387
7.3.2 Экспериментальное определение толщины оболочки липосомы и состава нерастворимого иммунного комплекса 389
7.4 Другие применения синтезированных наночастиц 400
7.5 Выводы по главе 403 ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ ПО ДИССЕРТАЦИИ 407 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 412

Список литературы

Заключение и выводы по диссертации
Результаты обзора и собственных исследований, представленные в данной работе, убедительно показывают, что золотые наночастицы с настраиваемым плазмонным резонансом будут широко использоваться в современной нанобиотехнологии в качестве меток резонансного рассеяния, фототермических преобразователей лазерного излучения, носителей антигенов, датчиков биосенсоров и для других перспективных приложений в биофотонике и биомедицине. Настройка каталитических, оптических и фототермических свойств наночастиц достигается несколькими способами, включая изменение размера, формы и структуры частиц или комбинацию этих способов.
Практически все поставленные задачи в диссертационной работе выполнены, конечно, с разной степенью полноты. Мы надеемся все же, что основная цель работы - оптимизация технологий применения наночастиц с ПР, - достигнута за счет отработки методик синтеза образцов с заданными свойствами, технологий функционализации их поверхности требуемыми лигандами, экспериментального и теоретического исследования^ индивидуальных и коллективных оптических свойств частиц, конъюгатов и кластеров. Кроме того, в процессе выполнения работы были реализованы несколько совместных проектов с другими исследователями по биомедицинским и биофизическим применениям полученных частиц.
Таким образом, основные результаты и выводы данной диссертации можно сформулировать следующим образом:
1. Предложена многослойная модель биоконъюгатов наночастиц
коллоидного золота и золотых нанооболочек для описания изменения
оптических свойств при адсорбции молекул-зондов (синтез конъюгата)
и их взаимодействии с молекулами-мишенями. Показано, что основные
спектральные изменения происходят при формировании первичной 5-
нм биополимерной оболочки и установлен универсальный характер
зависимости спектрального сдвига плазмонного резонанса от объемной
407
доли оболочки. Обнаружены области оптимальных размеров золотых наночастиц с максимальным оптическим откликом на присоединение к конъюгату молекул-мишеней. При отношении радиуса ядра к толщине золотых нанооболочек 0.2-0.4 изменения их спектров больше, чем для эквиобъемных частиц коллоидного золота.
2. Экспериментально исследована адсорбция 1§0, трипсина и желатина на 18-нм и 34-нм золотых частицах с использованием методов спектроскопии поглощения, статического и динамического рассеяния света. Определена толщина адсорбционного слоя: 3-5 нм для трипсина, 5-6 нм для и 15-18 нм для желатина. Для глобулярных белков согласие с экспериментальными спектрами экстинкции и рассеяния дает двухслойная модель с однородной полимерной оболочкой, а в случае желатина — неоднородная модель адсорбции.
3. Экспериментально измерен спектр деполяризации суспензии золотых наностержней, получено максимальное значение деполяризации около 50% и подтвержден теоретический вывод о возможности наблюдения значений деполяризации рассеяния линейно поляризованного света между пределами диэлектрических игл (33%) и стержней с плазмонным резонансом (75%). Ключевым фактором для экспериментального наблюдения ' высоких значений деполяризации является очистка препарата наностержней от побочных наночастиц. Экспериментально показана корреляция между сдвигом плазмонного резонанса экстинкции и положением максимума деполяризации.
4. Исследованы мультипольные плазмонные резонансы в золотых наностержнях и их зависимость от размера, осевого отношения и ориентации по отношению к направлению и поляризации возбуждающего света. Предложена схема спектрального картирования мультипольных резонансов при увеличении осевого отношения частицы и сформулировано правило вкладов: резонанс с номером п является суммой мультипольных вкладов с номерами 1>п соответствующей четности. Показано • выполнение линейных соотношений между длиной волны» резонанса и осевым отношением, деленным на номер резонанса, а также между спектральным сдвигом и инкрементом показателя преломления внешней среды.
5. Экспериментально получены и охарактеризованы методами спектроскопии поглощения и рассеяния, электронной микроскопии и энерго-дисперсионной рентгеновской спектроскопии стабильные образцы золотых наностержней с контролируемой толщиной серебряной нанооболочки от 0 до 4 нм и тонкой контролируемой: настройкой плазменного резонанса от 900 до 550 нм с точностью до 10 нм. Разработан? метод оценки толщины серебряной; нанооболочки стержней типа Au/Ag. по относительному спектральному сдвигу резонансов.
6: Усовершенствована технология получения золотых нанооболочек за счет включения, этапа определения концентрации силикатных ядер и целевых наночастиц по измерениям спектров экстинкции. Экспериментально и теоретически исследовано влияния« степени полидисперсности толщины оболочки^и ограничения длины свободного5 пробега электронов (размерный эффект) на спектры резонансного, рассеяния: суспензий. Для: тонких оболочек; основное уширение дает размерный эффект, а для толстых — полидисперсность. Оба вклада увеличиваются с увеличением отношения радиуса ядра, к толщине золотой оболочки. Размерный эффект приводит к одинаковому уширению спектров металлических нанооболочек и. трехслойных металло-диэлектрических структур.
7. Выполнен комплексный анализ оптического усиления поглощения для* развития нанотехнологии фототермальной лазерной терапии. Исследованы оптические свойства единичных золотых наносфер,. наностержней, нанооболочек, а также 1, 2 и 3D агрегатов сферических, частиц с учетом согласования настройки трех важнейших параметров:
максимума резонансного поглощения частиц, длины волны лазерного излучения и области оптической прозрачности биотканей (около 800 нм). Наиболее эффективными одночастичными структурами являются наностержни с толщиной 15-20 и длиной 50-70 нм или золотые оболочки с диаметром ядра 50-100 нм и толщиной оболочки 5-10 нм. Основными параметрами, влияющими на поглощение кластера, являются относительное межчастичное расстояние в кластере и наличие в его структуре фрагментов линейных цепочек.
Исследованы коллективные плазмонные резонансы золотых и серебряных бисфер и показано, что дипольное приближение некорректно описывает спектр взаимодействующих частиц. При решении системы связанных Т-матричных уравнений необходим учет высоких мультипольных мод, хотя! сами оптические характеристики взаимодействующих частиц определяются первыми тремя-четырьмя мультипольными вкладами.
Исследованы коллективные оптические свойства монослоя золотых нанооболочек с дипольным и квадрупольным плазмонными резонансами. Показано, что эффективное подавление дипольной полосы экстинкции связано с подавлением полосы рассеяния, а не поглощения; и является общим физическим свойством плотноупакованных ' монослоев наночастиц.
8. С использованием модифицированного протокола синтеза получены и охарактеризованы методами спектроскопии поглощения, рассеяния и электронной микроскопии серебряные нанокубики и золотые наноклетки с размерами 40-50 нм и плазмонным резонансом около 800 нм. Показано, что наноклетки обладают более высокой эффективностью преобразования света в тепло при равной концентрации металла по сравнению с наностержнями и нанооболочками и перспективны в качестве синих и красных меток при визуализации биоструктур.
9. Предложено в качестве универсального биомаркера использовать ПЭГ- покрытые или биоспецифически функционализованные частицы, состоящие из силикатного ядра со средним диаметром 120 нм и толщиной золотой оболочки 15-20 нм. Эти маркеры нашли применение в дот-иммуноанализе, фототермолизе, биоимиджинге и оптической томографии. Показана деструкция нанооболочек мощными 4-нс импульсами лазера (900-1064 нм), сопровождаемая изменением спектра экстинкции, образованием 5-30 нм частиц КЗ и формированием парового пузырька со временем жизни до 5 мкс. Теоретически и экспериментально показана, возможность увеличения чувствительности твердофазного дот-иммуноанализа на два порядка, за счет замены» наночастиц коллоидного золота на золотые нанооболочки.
10. Синтезированные наночастицы были использованы в исследованиях
i
размерных эффектов циркуляции и биораспределения, динамики нагрева частиц в экспериментах in vitro и in vivo, в комплексном анализе контрастирования ОКТ-изображений кожи, в разработках количественного метода оценки эффективности мечения клеток, технологии лазерного спекания имплантов, создания, полиэлектролитных микрокапсул с оптически управляемыми параметрами, нанокомпозитных ЖК-ячеек, методик микроскопической характеристики оптического захвата наночастиц и их броуновского движения, методик анализа антимикробной активности смесей золотых наночастиц и антибиотиков.
11. В' рамках развития общей идеологии исследования структуры наночастиц методами светорассеяния, разработан и экспериментально апробирован универсальный подход для определения среднего размера и толщины оболочки липосом и оценки структуры частиц нерастворимых иммунных комплексов на основе комбинирования измерений волнового экспонента, удельной мутности и данных динамического рассеяния света.