Изучение взаимодействия аптамеров с охратоксином А: количественные закономерности и аналитическое применение Самохвалов Алексей Владимирович

Краткое описание

Самохвалов,АлексейВладимирович.ИзучениевзаимодействияаптамеровсохратоксиномА:количественныезакономерностиианалитическоеприменение: диссертация ... кандидата химических наук : 03.01.04 /СамохваловАлексейВладимирович; [Место защиты: Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук]. - Москва, 2019. - 145 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
Институт биохимии им А.Н. Баха РАН На правах рукописиСАМОХВАЛОВАЛЕКСЕЙВЛАДИМИРОВИЧИЗУЧЕНИЕВЗАИМОДЕЙСТВИЯАПТАМЕРОВСОХРАТОКСИНОМА:КОЛИЧЕСТВЕННЫЕЗАКОНОМЕРНОСТИИАНАЛИТИЧЕСКОЕПРИМЕНЕНИЕ03.01.04 Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель:

стр. 2
.................................... 19 1.1.4 Определение константывзаимодействияаптамер-лиганд .................................... 23 1.1.5. Области практическогопримененияаптамеров.................................................... 24 1.2.ПРИМЕНЕНИЕПОЛЯРИЗАЦИИ/АНИЗОТРОПИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ: ХАРАКТЕРИСТИКААПТАМЕР-ЛИГАНДНОГОВЗАИМОДЕЙСТВИЯИ СОЗДАНИЕАНАЛИТИЧЕСКИХСИСТЕМ ..... 32 1.2.1 Принцип поляризации/анизотропии флуоресценции....

стр. 7
Поэтому крайне важна разработка решений для простой и экспрессной детекции ОТА, в том числе основанных на биорецепторныхвзаимодействиях. Однакоприменениеаптамеровв качестве биоаналитических реагентов, распознающих ОТА, требует проведения всестороннегоизучениявзаимодействияаптамер ОТА. Перспективным средством как для характеристикивзаимодействияаптамер ОТА, так и для регистрациианалитическогосигнала при определении ОТА...

Оглавление диссертациикандидат наук Самохвалов Алексей Владимирович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Нуклеиновые кислоты в роли рецепторных молекул
1.1.1 Нуклеиновые кислоты: история исследования и предпосылки к изобретению SELEX метода
1.1.2 Получение нуклеиновых кислот с заданными свойствами методом «SELEX»
1.1.3 Нуклеиновые кислоты в качестве рецепторов. Аптамеры
1.1.4 Определение константы взаимодействия аптамер-лиганд
1.1.5. Области практического применения аптамеров
1.2. Применение поляризации/анизотропии флуоресценции: характеристика
аптамер-лигандного взаимодействия и создание аналитических систем
1.2.1 Принцип поляризации/анизотропии флуоресценции
1.2.2 Определения константы лиганд-рецепторного взаимодействия методом анизотропии флуоресценции
1.2.3. Применение поляризационного флуоресцентного метода для определения низкомолекулярных соединений с использованием аптамеров
1.3. Структура, свойства и методы обнаружения охратоксина А
1.3.1 Практическая значимость определения охратоксина А
1.3.2 Аптамеры, специфичные к охратоксину А
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы и оборудование
2.2 Методы
2.2.1 Спектроскопия кругового дихроизма
2.2.2 Синтез и очистка охратоксина А, меченного 4'-(аминометил)флуоресцеином
2.2.3 Определение концентрации ОТА-ФЛУ
2.2.4 Определение константы взаимодействия аптамер-ОТА методом анизотропии флуоресценции
2.2.5 Характеристика взаимодействия аптамер-ОТА методом равновесного диализа
2.2.6 Получение флуоресцентных матриц экстинкции-эмиссии комплексов меченого и немеченого охратоксина А с аптамером
2.2.7 Синтез конъюгатов аптамеров со стрептавидином и конъюгатов аптамер-стрептавидин-антитело
2.2.8 Характеристика комплексов аптамер-белок методом ассиметричного проточного фракционирования в поле поперечных сил (AF4)
2.2.9 Получение мелкодисперсных наночастиц золота
2.2.10 Характеристика размеров наночастиц и их конъюгатов методом просвечивающей электронной микроскопии
2.2.11 Динамическое и электрофоретическое рассеивание света
2.2.12 Синтез стрептавидиновых конъюгатов с наночастицами золота
2.2.13 Синтез конъюгатов аптамер-стрептавидин- наночастицы золота
2.2.14 Поляризационный флуоресцентный аптамерный анализ
2.2.15 Подготовка проб вина для определения ОТА
2.2.16 ПФ аптамерный анализ (ПФАА) охратоксина А в вине
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Выбор охратоксин А-связывающего аптамера
3.1.1 Сравнительная характеристика ОТА-связывающих аптамеров
3.1.2. Синтез производного ОТА, меченного флуоресцеином
3.1.3 Характеристика связывающих свойств аптамеров, специфичных к охратоксину А
3.1.4 Характеристика структуры ОТА-связывающих аптамеров методом кругового дихроизма
3.2 Определение константы взаимодействия аптамер-ОТА
3.2.1 Определение константы взаимодействия методом анизотропии флуоресценции
3.2.2. Подтверждение константы связывания методом равновесного диализа
3.3. Характеристика взаимодействия аптамер-охратоксин А по изменению собственной флуоресценции охратоксина А
3.3.1 Анализ матриц экстинкции-эмиссии ОТА в свободном состоянии и в комплексе с аптамером
3.3.2. Зависимость интенсивности флуоресценции ОТА от концентрации аптамера
3.3.3. Зависимость флуоресценции ОТА в комплексе с аптамером при Хех/Хеш = 265/425 нм от концентрации ОТА
3.3.4. Характеристика взаимодействия ОТА-аптамер по собственной флуоресценции ОТА
3.4. Разработка белковых якорных систем для аптамерного
поляризационного флуоресцентного анализа
3.4.1 Принцип молекулярных якорей
3.4.2 Разработка ПФ аптамерного анализа с использованием якорей на основе белков и сравнение с анализом на основе нативного аптамера
3.4.3 Выбор оптимального белкового якоря
3.4.4 Сравнение предела обнаружения ПФ анализа с нативным аптамером и белковым якорным усилением
3.5. Разработка ПФ аптамерного анализа ОТА с использованием якоря на
основе конъюгатов наночастиц золота
3.5.1 Получение и характеристика наночастиц золота
3.5.2 Теоретический расчет количества стрептавидина и аптамера, иммобилизованного на поверхности золотых частиц
3.5.3 Синтез и характеристика конъюгатов наночастиц золота со стрептавидином и с
аптамером
3.5.4 Разработка методики ПФ аптамерного определения ОТА
3.6. Апробация разработанной аналитической системы для определения ОТА в пробах вина
3.6.1 Сравнение предложенных подходов для определения ОТА в пробах вина
3.6.2. Исследование ОТА-положительных проб вина методом ПФ аптамерного анализа
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ