Морфология лимфоидных клеток при спонтанном и экспериментальном гемобластозах крупного рогатого скота: Электронно-микроскопические исследования Меньшикова, Зинаида Николаевна

Краткое описание

Меньшикова, Зинаида Николаевна.
Морфология лимфоидных клеток при спонтанном и экспериментальном гемобластозах крупного рогатого скота : Электронно-микроскопические исследования : диссертация ... доктора ветеринарных наук : 16.00.02. - Москва, 1999. - 110 с. : ил.
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИдоктор ветеринарных наук Меньшикова, Зинаида Николаевна
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на отчетных научных конференциях Московской ветеринарной академии им. К.И.Скрябина (1976-1996 гг.), на координационныхвещаниях программы по решению НТП 0.69.05 "Лейкозы человека и животных" Государственного комитета по науке и технике (1976-1990), на VIII, IX Всесоюзных научно-методических конференциях по патологической анатомии-х. животных (Витебск, 1981; Казань, 1984), на Международноммпозиуме поавнительному изучению лейкемии и родственных заболеваний (Пицунда, 1979); Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунотерапия животных" (Самарканд, 1984); Всесоюзноммпозиуме "Первично-локализованные опухоли кроветворной ткани приматов и
9 t' " i > с л человека, пути генерализации" (Сухуми, 1986); II Всесоюзномезде гематологов и трансфузиологов (Львов, 1985); Всемирном ветеринарном конгрессе (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 1991); Всероссийской научно-методической конференции по патологической анатомии-х. животных (Воронеж, 1993), Международная научно-практическая конференция, посвященная 40-летию ВНИИВВиМ (Покров, 1998)
Результаты работы экспонировались на ВДНХ СССР 1983 г., в 1987г. Главным комитетом ВДНХ награждены бронзовой медалью (Постановление от 23.07.87).
П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Объектом исследования служили 237 гол. крупного рогатого скота [ерно-пестрой (210 гол.), костромской (14 гол.) и бушуевской (13 гол.) пород. Животные были разделены на следующие группы: 74 коровы клинически здоровые, серологически отрицательных в реакции имму-нодиффузии (РИД) к антигенам ВЛКРС; 77 гол. серологически положительных, 86 коров больных различными формами гемобластозов, серологически положительных к антигенам ВЛКРС.
Диагноз поставлен на основании клинико-гематологических (Петровский Г.С.), вирусологических (Крикун В.А.) и патолого-морфологических (Сноз Г.В.) исследований, проведенных в динамике развития лейкозного процесса, при убое животных или их гибели с характерными признаками лейкоза. Животные обследовались гематологически: в крови у здоровых коров 4,5-9,0 тыс/мкл лейкоцитов (50-60% лимфоцитов), больных животных 16,5-365,0 тыс/мкл лейкоцитов (8090% лимфоцитов), в лимфе 4,5-16,0 тыс/мкл лейкоцитов (95% лимфоцитов).
В качестве контроля были взяты нативные и культивированные лимфоциты крупного рогатого скота с индуцированной аденовирусной инфекцией (5 телят в возрасте 1 мес.)* и болезнями незаразной этиологии: маститы, эндометриты, травматический ретикулит, бронхопневмония. В крови данных животных было 12,5-36,0 тыс/мкл лейкоцитов с 5075% лимфоцитов (15 гол).
Экспериментальными моделями служили крупный рогатый скот: 3 гол. бурой латвийской породы, 9 гол. черно-пестрой и 3 гол. бушуевской пород; гетерологичные виды: овцы - 16 гол. романовской и 22 гол. каракульской пород и 5 гол. породы меринос; козы - 5 гол.; кролики - 10 гол.
Все животные подбирались по принципу аналогов со сходной зоотехнической характеристикой: порода, пол, возраст. В качестве материала для заражения крупного рогатого скота (телята в
Материал любезно предоставлен профессором Белоусовой Р.В, возрасте 1 год) использовали культуральную жидкость 48-часовой культуры лейкоцитов крови лейкозной коровы, содержавшую ВЛКРС, вводили внутрибрюшинно в дозе 100,0 мл . Кроме того использовали очищенный онкорнавирус и цельную кровь коровы, больной лейкозом. Ягнят в возрасте 3-х месяцев, свободных от онкорнавирусной инфекции заражали дважды с интервалом 3 месяца нативными лимфоцитами крови коровы, больной XJIJI, дозами 625x10б клеток в объеме 1 мл внутрибрюшинно, внутривенно, внутрикожно (Салимов Х.С., Крикун В.А.).
Козлят в возрасте 14-36 дней заражали 45 мл крови больной овцематки (L - 560 тыс/мкл, 99% лимфоцитов) и кровью лейкозной коровы (L 190,0 тыс/мкл) 20 мл подкожно (Андриян Е.А.). В процессе исследований были использованы клетки линии тимуса эмбриона крупного рогатого скота - МВА-76 "продуцента" онкорнавируса типа С (ТЭК МВА-76) (Крикун В.А. и соавт., 1978).
Материалом для трансмиссионной и растровой электронной мик роскопии служили нативные лимфоциты крови и лимфы и культивированные in vitro. Пробы крови брали из яремной вены, лимфу от коров получали сразу после выведения грудного протока или на 2-ой день после операции (Иткин Б.З., Петраков К.А.), в количестве 100-150 мл. Культуры лимфоцитов готовили по общепринятой методике. Лимфоциты лимфы выделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Выделение лимфоцитов и их подготовку к электронной микроскопии проводили по методу Anderson (1969) в нашей модификации. Из лимфоцитов периферической крови и центральной лимфы крупного рогатого скота, овец, коз и кроликов подготовлено и изучено 5820 блоков. Исследовано 325 краткосрочных культур лейкоцитов и одна перевиваемая вируспродуцирующая культура ТЭК МВА-76 на разных пассажах. Ультратонкие срезы контрастировали уранилаце-татом и цитратом свинца. Препараты изучали в электронном микроскопе JEM 100 С при 80 кв.
Для растровой электронной микроскопии препараты готовили по стандартной методике, изучали и фотографировали на пленку при увеличении 5 х 10000 раз в электронном микроскопе JEM 100С со сканирующей приставкой. В каждом препарате просматривали не менее 250 клеток. Всего проанализировано более 15000 снимков.
Результаты экспериментов обработаны статистически, достовер ность различий оценивали по Стьюденту.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Электронно-микроскопическое исследование лимфоидных клеток крови и лимфы клинически здорового крупного рогатого скота.
2.1.1. Ультраструктура лимфоцитов крови здорового крупного рогатого скота из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств.
Комплексное изучение свойств лейкозных клеток при спонтанном и экспериментальном лейкозах человека, крупного рогатого скота и лабораторных животных позволило выявить достоверные качественные и количественные ультраструктурные отличия их от нормальных клеток той же степени дифференцировки.
Ультраструктура нормальных, интактных лимфоцитов изучалась ла 54 гол. крупного рогатого скота трех пород: черно-пестрой, костромской, бушуевской. Все животные имели нормальные гемограммы и были клинически здоровы.
Изучение клеток лимфоидного ряда в электронном микроскопе показало, что по размерам и морфологии они неоднородны. Наиболее приемлема для крупного рогатого скота, на наш взгляд, классификация, разработанная для лимфоцитов крови человека Э.И.Терентьевой и Г.И.Козинцом (1972). Взяв за основу данную классификацию мы выделили и описали лимфоидные клетки у здорового крупного рогатого скота.
Малые светлые лимфоциты у здоровых, неинфицированных ВЛКРС животных представляли самую большую, в процентном соотношении, группу клеток. Они имели ровную или с небольшим количеством ворсинок и выступов клеточную поверхность, высокое ядерно-цитоплазматическое отношение. Большую часть клетки занимало округлое, иногда с глубокими выпячиваниями, ядро, окруженное узким или широким ободком цитоплазмы. Гетерохроматин ядер плотный, распределен в виде конденсированных глыбок у ядерной мембраны. Основную часть ядра занимал мелкозернистый или аморфный эухроматин. В некоторых клетках обнаруживали :омпактное ядрышко. Цитоплазма электронно-светлая, бедна »рганеллами, содержала 1-3 митохондрии конденсированного типа. Эндоплазматическая сеть слабо развита, в виде небольших канальцев и вакуолей. Аппарат Гольджи выявляли редко, он состоял, как правило, из мелких пузырьков и единичных цистерн.
Малые темные лимфоциты имели структуру аналогичную малым светлым лимфоцитам, но в цитоплазме находили визуально значительно больше свободных рибосом, которые придавали клетке темный вид, и крупные митохондрии (5-6) с хорошо выраженным рисунком крист.
Большие лимфоциты встречались редко, имели ровную или извилистую клеточную поверхность, низкое ядерно-цитоплазматическое отношение.
Ядро округлое или овальное располагалось эксцентрично, аморфно зернистый
Таблица №
Характеристика животных
Группа животных Серология (РИД) Количество лейкоцитов, тыс/мкл % встречаемости ЯК (250 кл на 1 гол.)
Животные из благополучных по лейкозу хозяйств
1. Клинически здоровые (п=51) 4,7-8,
Животные из неблагополучных по лейкозу хозяйств
2. Клинически здоровые (п=26) 3,2 - 6,2 0,57 ±0,
3. а) инфицированные ВЛКРС до 2% ЯК, (п=27) б) инфицированные ВЛКРС до 4% ЯК, (п=30) в) инфицированные ВЛКРС ЯК выше 4%, (п=24) + + + 5,3-7,5 5,3 - 9,2 5,8-11,6 1,13 ±0,24 2,95 ± 0,95 6,67 ± 1,
4. Начальная стадия ХЛЛ, (п=15) + 16,6 - 32,5 7,13 ± 1, хроматин располагался неравномерно с участками уплотнения в центре и у ядерной мембраны.
Лимфоплазмациты встречались крайне редко и характеризовала хорошо развитой сетью гранулярного эндоплазматического ретикулу-ма. Общим для всех четырех видов клеток было отсутствие патологических изменений в ядре: ядерных карманов и ядерных инвагинатов. Нами проведены исследования клинически здоровых, серонегативных коров (26 гол.) из неблагополучного по лейкозу хозяйства. Лимфоциты крови были представлены в основном малыми светлыми и единичными большими лимфоцитами по ультраструктуре однотипными с подобными клетками здоровых животных из благополучных по лейкозу хозяйств. Однако некоторые животные имели в ядрах лимфоидных клеток ядерные карманы. Данные аномалии находили в среднем у 0,57 ± 0,14% клеток с колебаниями от 0,4 до 0,8% (табл. 1).
Таким образом лимфоциты коров серологически отрицательных в РИД из благополучных по лейкозу хозяйств не имеют изменений в структуре клеточных органелл. Они появляются у аналогичных животных из неблагополучных по лейкозу хозяйств, в среднем 1%.
2.1.2. Ультраструктура лимфоцитов лимфы клинически здорового крупного рогатого скота.
Наименее изученным звеном в системе лимфопоэза остается ультраструктура лимфоцитов лимфы крупного рогатого скота. Анализ литературных данных показал, что до настоящего момента не было специальных исследований по сравнительному изучению лимфоидных леток периферической крови и центральной лимфы крупного рогатого кота. Вопрос изучения клеточного субстрата лимфы здоровых животных остается важным, так как является отправным моментом изучения патогенеза лейкозов.
При электронно-микроскопическом изучении морфологии клеточного состава лимфы крупного рогатого скота из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств установлено, что клеточная популяция лимфы здоровых животных содержит несколько вариантов, различающихся по ультраструктуре, клеток лимфоидного ряда с небольшой примесью эритроцитов, полиморфно-ядерных лейкоцитов и гранулоцитов.
Первым, доминирующим типом клеток были лимфоциты диаметром 4-6 мкм, с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, которое было в пределах 0,83-0,92. Такие клетки имели крупное, округлое или овальное ядро, располагающееся в центре клетки, часто с узкими глубокими впячиваниями.
Цитоплазма отличалась повышенной электронной плотностью и была бедна органеллами, среди которых были лишь рибосомы, единичные пиноцитозные пузырьки и 1-2 мелкие митохондрии с электронно-светлым матриксом и четко очерченными кристами.