Новые протеиназы грамотрицательных и грамположительных бактерий: характеристика, свойства и практическое применение Марданова Айслу Миркасымовна

Краткое описание

Марданова,АйслуМиркасымовна.Новыепротеиназыграмотрицательныхиграмположительныхбактерий:характеристика,свойстваипрактическоеприменение: автореферат дис. ... доктора биологических наук : 03.02.03 /МардановаАйслуМиркасымовна; [Место защиты: Казанский (Приволжский) федеральный университет]. - Казань, 2020. - 47 с.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
На правах рукописиМардановаАйслуМиркасымовнаНОВЫЕПРОТЕИНАЗЫГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХИГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХБАКТЕРИЙ:ХАРАКТЕРИСТИКА,СВОЙСТВАИПРАКТИЧЕСКОЕПРИМЕНЕНИЕ03.02.03 Микробиология Автореферат Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Казань 2020 Работа выполнена в

стр. 6
исследований вносят вклад в расширение представления о разнообразиипротеиназв клеткахграмотрицательныхиграмположительныхбактерий. Систематизация знаний, выделение ихарактеристикановыхпротеолитических ферментов с различной субстратной специфичностью являются фундаментом дляпрактическогоиспользования

стр. 39
группбактерийграмотрицательныхэнтеробактерий играмположительныхбацилл показал, чтобактерииобладают широким арсеналомпротеиназс различнымисвойствами. Геномыбактерийнасыщены генами протеолитических ферментов: в геноме S. grimesii их количество составляет 3.5% от всех белок-кодирующих генов.

Оглавление диссертациидоктор наук Марданова Айслу Миркасымовна
СОДЕРДЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Протеолитические ферменты бактерий: основы классификации и общие базы
1.1.1 Металлопротеиназы бактерий
1.1.2 Сериновые пептидазы
1.2 Функциональная роль протеиназ 30 1.2.1 Роль протеиназ в ответе на стресс и адаптации бактерий 31 1.2.2. Роль бактериальных протеиназ в инфекционной патологии
1.2.2.1 Внеклеточные (секретируемые) протеиназы как факторы вирулентности
1.2.2.2 Бактериальные протеиназы как мишени для терапии
1.3 Использование бактериальных протеиназ в различных областях
1.3.1 Использование бактериальных протеиназ в народном хозяйстве
1.3.2 Использование протеиназ в медицине 50 Заключение к обзору литературы
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Штаммы бактерий, плазмиды, культура эукариотических клеток
2.2 Питательные среды и условия культивирования
2.3 Выделение клеточного экстракта бактерий и определение концентрации белков
2.4 Определение протеолитической активности
2.5 Выделение и очистка белков
2.5.1 Выделение актина
2.5.2 Выделение актиноподобных и альфа-актининоподобных белков цианобактерий
2.5.3 Выделение и очистка протеиназ
2.6 Исследование физико-химических и биологических свойств протеиназ
2.6.1 Ингибиторный анализ
2.6.2 Исследование субстратной специфичности протеиназ
2.6.3 Характеристика энзиматических свойств протеиназ
2.6.4 Анализ фибринолитической, тромболитической и антикоагулянтной активностей протеиназ бацилл
2.6.5 Способность протеиназ к разрушению бактериальных биопленок
2.6.6 Оценка способности субтилизиноподобной протеиназы B. amyloliquefaciens к синтезу пептидных связей
2.7 Электрофорез
2.8 Идентификация N-концевой последовательности
2.9 Иммунологические исследования
2.9.1 Используемые антитела
2.9.2 ELISA и Western-иммуноблотинг
2.10 Выделение ДНК, ПЦР-амплификация и секвенирование ДНК
2.11 Биоинформатический анализ
2.12 Исследование инвазивных свойств энтеробактерий
2.12.1 Гентамициновый метод
2.12.2 Определение жизнеспособности клеток HeLa
2.12.3 Влияние внеклеточных метаболитов бактерий на монослой культуры клеток HeLa
2.13 Методы микроскопии
2.14 Получение актина, меченого 1,5-IAEDANS
2.15 Измерение спектра флуоресценции
2.16 Ингибирование ДНКазной активности
2.17 Статистическая обработка 73 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
НОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
3.1 Выделение протеиназы из клеток Serratiagrimesii А2
3.1.1 Динамика накопления специфической активности в клетках бактерий S. grimesii 74 А2
3.1.2 Очистка протеиназы из клеточного экстракта S. grimesii А2
3.1.3 Характеристика протеиназы ECP
3.1.3.1 Влияние рН, температуры и ингибиторов на активность протеиназы
3.1.3.2 Протеолиз актина протеиназой ЕСР 32-гримелизином
3.1.3.3 Локализация пептидных связей, расщепляемых гримелизином при 81 ограниченном протеолизе актина, и субстратная специфичность протеиназы
3.2 Использование гримелизина для исследования молекулярных свойств актина
3.2.1 Характер расщепления нативного актина и сохранение его структуры
3.2.2 Способность «расщепленного» актина к полимеризации
3.2.3 Анализ структурных эффектов, индуцируемых взаимодействием ДНКазы I с 87 актином в мономерной форме или в комплексе с CapZ
3.2.3.1 Взаимодействие «расщепленного» актина с ДНКазой I
3.2.3.2 Влияние расщепления связи между 42-43 аминокислотными остатками 89 молекулы актина на формирование комплекса ДНКазы I с актином
3.2.3.3 Структурные модификации субдомена-1 молекулы актина при связывании с 90 ДНКазой I
3.2.3.4 Влияние ДНКазы-I на взаимодействие мономерного актина с белком CapZ
3.3 Секвенирование, аннотация и анализ генома S. grimesii A2
3.3.1 Морфология и физиология бактерий S. grimesii A2
3.3.2 Характеристика генома S. grimesii А2 и сравнение с геномами разных видов 97 Serratia
3.3.3 Анализ оперона, в который входит ген гримелизина
3.3.4 Поиск генов, кодирующих белки с пептидазной активностью в геноме S. grimesii 106 A2
3.4 Биоинформатический поиск в геномах различных видов бактерий генов 107 ортологов гримелизина и анализ геномных локусов
3.4.1 Скрининг геномов различных бактерий на наличие генов-ортологов ЕСР 107 32/гримелизина S. grimesii
3.4.2 Структурная организация локусов генов металлопротеазы в геномах разных 110 энтеробактерий
3.5 Идентификация и анализ генов гипотетических металлопротеиназ в геномах 113 штаммов Morganella morganii ZM и Providencia stuartii NK
3.5.1 Секвенирование последовательности генов-аналогов гримелизина
3.5.2 Анализ протеолитической активности в клетках M. morganii ZM и P. stuartii NK
3.5.3 Выделение внутриклеточной металлопротеиназыM. morganii ZM
3.6 Внеклеточные металлопротеиназы энтеробактерий
3.6.1 Идентификация внеклеточной металлопротеиназы S. grimesii A2
3.6.2 Особенности биосинтеза внеклеточной протеиназы Proteus mirabilis
3.6.3 Цитотоксическое действие секретируемых протеиназ энтеробактерий на клетки 128 HeLа
3.7 Характеристика инвазии бактерий M. morganii ZM, P. stuartii NK и P. mirabilis 129 5127-1 клеток M HeLa
3.7.1 Жизнеспособность клеток M HeLa в зависимости от инфицирующей дозы 129 бактерий P. mirabilis 5127-1 и M. morganii ZM
3.7.2 Влияние инфицирующей дозы и возраста бактериальной культуры на 129 инвазивные свойства бактерий
3.7.3 Изучение морфологии клеток HeLa, инфицированных энтеробактериями, 133 методом конфокальной микроскопии
3.8 Актино- и а-актининоподобные белки у цианобактерий
3.8.1 Очистка и структурные характеристики актиноподобного белка из Synechocystis 138 и его взаимодействие с очищенными мышечными белками
3.8.2 Характеристика актино- и а-актининоподобных белков в Spirulina
НОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ БАЦИЛЛ
3.9 Выделение сериновых протеиназ бацилл и оптимизация их биосинтеза
3.9.1 Динамика роста, биосинтеза сериновых протеиназ и спорообразования культур 145 Bacillus amyloliquefaciens Н2 и Bacillus pumilus КММ
3.9.2 Влияние компонентов питательных сред на эффективность синтеза протеиназ B. 147 amyloliquefaciens Н2 и B. pumilus КММ
3.9.3 Выделение из культуральной жидкости субтилизиноподобных протеиназ и 154 глутамилэндопептидаз B. amyloliquefaciens Н2 и B. pumilus КММ
3.10 Характеристика свойств внеклеточных протеиназ бацилл
3.10.1 Ингибиторный анализ активности протеиназ B. amyloliquefaciens и B. pumilus
3.10.2 Энзиматические свойства сериновых протеиназ B. amyloliquefaciens и B. 158 pumilus
3.10.3 Субстратная специфичность сериновых протеиназ B. amyloliquefaciens и B. 163 pumilus
3.11 Регуляция биосинтеза внеклеточных протеиназ бацилл
3.11.1 Взаимосвязь споруляции и биосинтеза внеклеточной протеиназы B. pumilus
3.11.2 Регуляция биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы
3.12 Потенциал использования бациллярных протеиназ в медицине
3.12.1 Характеристика фибринолитической, тромболитической и антикоагулянтной 172 активностей сериновых протеиназ B. amyloliquefaciens и B. pumilus
3.12.2 Способность субтилизиноподобных протеиназ B. amyloliquefaciens к
ферментативному синтезу пептидных связей
3.12.3 Влияние бациллярных протеиназ на биопленки
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Протеиназы энтеробактерий
4.2 Протеиназы бацилл
4.3 Применение бактериальных протеиназ
4.3.1 Использование гримелизина в исследованиях актина
4.3.2 Использование сериновых протеиназ бацилл 203 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 206 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 209 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 211 ПРИЛОЖЕНИЕ