Определение функциональной значимости взаимодействия катенина р120 с метил-ДНК связывающим белком Каизо Айтхожина, Дана Сабировна

Краткое описание

Айтхожина,ДанаСабировна.Определениефункциональнойзначимостивзаимодействиякатенинар120сметил-ДНКсвязывающимбелкомКаизо: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.26. - Москва, 2006. - 125 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
61:06-3/721 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМР1Я НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА На правах рукописиАЙТХОЖИНАДАНАСАБИРОВНАОпределениефункциональнойзначимостивзаимодействиякатенинар120 сметил-Д1ЖсвязывающимбелкомКаизоспециальность 03.00.26- молекулярная генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата

стр. 4
Характеристика сигнала ядерной локализацииКаизо82 3.11 АнализвзаимодействияКаизос р120 в дрожжевой двугибридной системе. 86 3.12 р120 снособен маскировать сигнал ядерной локализациибелкаКаизо. 3.13 Влияние р120 нафункциональнуюактивностьбелкаКаизо93 91 3.14 Уровень н клеточная локализациякатенина

стр. 89
третий домены цинковые пальцы. Недавно было показано, чтоКаизоне единственныйбелок, осуществляющийвзаимодействиес метилированнойДНКпосредством цинковых пальцев С2Н2 типа, он является членом семействаметил-ДНКсвязывающихбелков. У человека найдены еще 2 такихбелка, так называемые ZBTB4 и ZBTB33.

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Айтхожина, Дана Сабировна
Используемые сокращения.
Введение.
1. Обзор литературы.
1.1 Белки MBD семейства.
1.2. Белок Канзо и его особенности.
1.3 ДНК- связывающий домен цинковые пальцы.
1.4 р120- катенин и его особенности.
1.5 Белки NF-kB и IkB семейств: роль и регуляция.
1.6 Регуляция ядерного транспорта: NLS, NES и их регуляция.
1.7 Дрожжевая другибридная система.
2. Материалы и методы.
2.1 Методики.
2.2 Полимеразная цепная реакция.
2.3 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.4 Бактериальные штаммы и плазмиды.
2.5 Конструкции.
2.5.1 Конструкции, использованные в экспериментах по определению клеточной локализации Каизо.
2.5.2 Конструкции для поиска сигнала ядерной локализации.
2.5.3 Конструкции для дрожжевой двугибридной системы.
2.5.4 Конструкции, использованные в экспериментах по иммунопреципитации.
2.5.5 Получение конструкций, кодирующих функциональные домены Каизо с N- концевым FLAG и С- концевым НА пептидами.
2.5.6. Получение конструкций для эксперимента no in vitro фосфорилированию
Каизо.
2.6 Работа с дрожжами.
2.6.1 Культивирование дрожжей.
2.6.2 Получение дрожжевых компетентных клеток.
2.6.3 Трансформация дрожжевых компетентных клеток.
2.6.4 Маттинг.
2.7 Выделение ядерных белковых экстрактов.
2.8 Гель- фильтрационная хроматография.
2.9 Вестерн блот- гибридизация со специфическими антителами.
2.10 Иммунопреципитация и разделение белков в денатурирующем SDS- ПААГ.
2.11 Клеточные линии и трансфекции.
2.12 Иммунофлуоресцентный анализ.
2.13 Экспрессия рекомбинантных белков.
2.14 Эксперимент по задержке ДНК- белковых комплексов в геле.
2.15 Анализ статуса фосфорилирования белка Каизо.
2.15.1 Дефосфорилирование с помощью А,- фосфатазы.
2.15.2 Мечение белков 32Р in vivo.
2.15.3 Получение пептидов при помощи обработки трипсином.
2.15.4 Картирование фосфорилированных пептидов.
2.15.5 Анализ фосфорилирования аминокислот.
2.15.6 Анализ статуса фосфорилирования функциональных доменов белка
Каизо.
2.15.7. In vitro фосфорилирование Каизо.
2.16 Метилирование ДНК с помощью SssI- метилазы.
2.17 Тест на способность Каизо функционировать как метил- зависимый репрессор.
2.18 Тест на способность Каизо функционировать как метил- зависимый активатор.
3. Результаты и их обсуждение.
3.1 Каизо и р120 находятся в разных белковых комплексах в ядерных экстрактах клеток эритролейкемии человека К562.
3.2 Каизо подвергается пост- трансляционной модификации.
3.3 Каизо фосфорилирован по остаткам серина.
3.4 Каизо содержит 2 или 3 сайта фосфорилирования.
3.5 Каизо фосфорилирован по остаткам серина, расположенным в BTB/POZ домене.
3.6 МарКарКЗ киназа не фосфорилирует Каизо in vitro.
3.7 Фосфорилирование белка Каизо по остаткам серина, расположенным в BTB/POZ домене не препятствует связыванию Каизо с р120.
3.8 В дифференцированных клетках линии РС12 Каизо распределен по всей клетке.
3.9 Клеточная локализация Каизо регулируется ингибитором NF-kB (IkB).
3.10 Характеристика сигнала ядерной локализации Каизо.
3.11 Анализ взаимодействия Каизо с р120 в дрожжевой двугибридной системе.
3.12 р120 способен маскировать сигнал ядерной локализации белка Каизо.
3.13 Влияние р120 на функциональную активность белка Каизо.
3.14 Уровень и клеточная локализация катеннна р120 не изменены при генетическом нокауте Каизо.
4. Выводы.