Применение белкового сплайсинга для получения рекомбинантных полипептидов Степаненко, Василий Николаевич

Краткое описание

Степаненко,ВасилийНиколаевич.Применениебелковогосплайсингадляполучениярекомбинантныхполипептидов: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03. - Москва, 2006. - 126 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
НРАВАХ РУКОПИСИСТЕПАНЕНКОВасилийНиколаевичПрименениебелковогосплайсингадляполучениярекомбинантныхнолипептидов. Специальность 03.00.03 -молекулярная

стр. 12
были сделаны следующие выводы, касающиеся общей природы процессовбелковогосплайсинга: 1)Белковыйсплайсингкатализируется исключительно аминокислотными остатками содержащимися в интеине. 2)Белковыйсплайсинг- внутримолекулярный процесс. 3)Белковыйсплайсингне требует никаких коэнзимов или источников

стр. 32
независимых семейства [31,45]. -32- 1.7Применениебелковогоснлайсинга в биотехнологии. 1.7.1 Экспрессионные системы на основе ннтенновдляочистки и модификациирекомбинантныхбелков.Получениевысокоочищенныхрекомбинантныхбелкови пептидов является важной задачейбелковойхимии. Аффинная последовательность

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Степаненко, Василий Николаевич
Оглавление.
Список сокращений.
Введение.
Глава 1.
Интеины: механизм, распространение, эволюция и применение.
1.1. Введение.
1.2. Особенности первичной структуры интеинов.
1.3 Механизм белкового сплайсинга.
1.3.1 Канонический механизм белкового сплайсинга.
1.3.2 Белковый транс-сплайсинг.
1.3.3 Автопроцессинг белков Hedgehog семейства.
1.3.4 Белковый сплайсинг в интеинах, содержащих нетипичные аминокислоты в консервативных доменах.
1.4 Факторы, влияющие на реакцию белкового сплайсинга.
1.5 Эндонуклеазные домены интеинов. 28 1.5.1 Особенности первичной структуры. 28 1.5.2. Хоуминг интеинов.
1.6 Распространение и эволюция интеинов.
1.7 Применение белкового сплайсинга в биотехнологии.
1.7.1 Экспрессионные системы на основе интеинов для очистки и модификации рекомбинантных белков.
1.7.2 Реакция лигирования синтезированных белков.
1.7.3 Белковый транс-сплайсинг и применение составных интеинов в биотехнологии.
1.7.4 Применение интеинов для посттрансляционной активации белков. 47 1.7.5. Перспективы применения интеинов для очистки рекомбинантных белков и пептидов в промышленных масштабах.
Глава 2.
Применение интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов.
2.1 Введение.
2.2 Использование интеиновых систем для получения рекомбинантных полипептидов с N-концевым серином на примере тимозина-al.
2.2.1 Применение векторных систем на основе See VMA интеина.
2.2.2 Применение векторных систем на основе мутантного Cys(l)/Ala(l) See VMA интеина.
2.2.3 Создание и применение модифицированного Ssp DnaB мини-интеина.
2.3 Использование Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантных полипептидов с N-концевым гистидином. 69 2.3.1. Применение Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантого глюкагона. 69 2.3.2 Оптимизация третьего способа получения глюкагона.
2.3.3 Применение Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантого оксинтомодулина. 82 2.4 Применение Ssp DnaB мини-интеина для получения рекомбинантого эпидермального фактора роста человека и исследование влияния интеиновой части гибридного белка на рефолдинг целевого полипептида.
Глава 3.
Материалы и методы.
3.1. Реактивы.
3.2. Ферменты.
3.3. Материалы.
3.4. Препараты.
3.5. Олигодезоксирибонуклеотиды.
3.6. Бактериальные штаммы.
3.7. Плазмидные вектора.
3.8. Лабораторное оборудование.
3.9. Буферы и растворы.
3.10. Методы.
3.10.1. Электрофорез белков в ПААГ.
3.10.2. Приготовление компетентных клеток и их трансформация.
3.10.3. Определение концентрации белка.
3.10.4. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.
3.10.5. Отбор рекомбинантов при помощи гибридизации на нитроцеллюлозных мембранах.
3.10.6. Секвенирование плазмидной ДНК по методу Сенгера.
3.10.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
3.10.8. Амплификация ДНК in vitro.
3.10.9. Извлечение ДНК из геля.
3.10.10. Молекулярное клонирование.
3.10.11. Выделение гибридного белка в растворимой форме.
3.10.12. Расщепление гибридного белка на хитиновом сорбенте.
3.10.13. Получение гибридного белка в виде телец включения.
3.10.14. Солюбилизация телец включения.
3.10.15. Расщепление гибридного белка в растворе.
3.10.16. Препаративное получение глюкагона.
3.10.17. Ренатурация и автокаталитическое расщепление hEGF. 110 Первая схема: 110 Вторая схема: 112 Выводы. 113 Благодарности. 114 Список литературы.
Список сокращений
Amp - антибиотик ампициллин
АТР - аденозин-5'-трифосфат
БисАА (BisAA) - бисакриламид
БСА (BSA) - бычий сывороточный альбумин
ГБ - гибридный белок
ТА1, Та1 -тимозин альфа
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия
ДТТ (DTT) - 1,4-дитиотриэтол
Ssp DnaB - DnaB геликаза из штамма РСС6803 Synechocystis sp.
See VMA - субъединица А вакуолярной АТФазы из Saccharomyces cerevisiae dNTP - 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат ddNTP - 2',3'-дидезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат
ИПТГ (IPTG) - изопропилтио-Р-Б-галактозид
MESNA - 2-меркаптоэтансульфоновая кислота
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЭГ - полиэтиленгликоль pGEM-5Zf(") - неэкспрессионная плазмида pTYBl 1 - экспрессионная плазмида, содержащая интеин See VMA pTWINl - экспрессионная плазмида, содержащая интеин Ssp DnaB
РНК - рибонуклеиновая кислота
ТЕМЕД - К,К,К',Ы'-тетраметилэтилендиамин
Трис - трис(гидроксиметил)метиламин ц-АМФ - циклический аденозин-5'-монофосфат
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ТВ - тела включения
МВР - мальтозо-связывающий белок
Hh - белки Hedgehog семейства
А.К. - аминокислота
А.О. - аминокислотный остаток
EPL - метод лигирования синтезированных белков
X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактопиранозид