Разработка и оценка эффективности тканеинженерного сосудистого имплантата на основе биодеградируемой полимерной матрицы Попов Гурий Иванович

Краткое описание

Попов Гурий Иванович. Разработка и оценка эффективности тканеинженерного сосудистого имплантата на основе биодеградируемой полимерной матрицы: диссертация ... кандидата Медицинских наук: 14.01.26 / Попов Гурий Иванович;[Место защиты: ФГБВОУВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации], 2019
Разработка и оценка эффективности тканеинженерного сосудистого имплантата на основе биодеградируемой полимерной матрицы Попов Гурий Иванович
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
кандидат наук Попов Гурий Иванович
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ В СОСУДИСТОЙ ХИРУРГИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Основные методы разработки тканеинженерных сосудистых имплантатов

1.2 Каркас (матрица) для создания тканеинженерного сосудистого имплантата

1.3 Клеточный материал для создания тканеинженерного сосудистого имплантата

1.4 Факторы биологической и механической природы, необходимые для создания

тканеинженерного сосудистого имплантата

1.5 Методы посева и культивирования клеточного материала на матрице

1.6 Послойный метод создания тканеинженерного сосудистого имплантата

1.7 Децеллюляризированные сосудистые имплантаты

1.8 Тканеинженерный сосудистый имплантат на основе грануляционной ткани

1.9 Метод использования биодеградируемых полимерных матриц

1.10 3Б-биопринтинг

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Получение полимерной матрицы из микроволокон методом электроплетения

2.2 Изучение физических свойств полимерных матриц

2.3 Исследование микроструктуры матриц

2.4 Оценка биосовместимости полимерной матрицы на основе поли(Ь-лактида)

2.5 Стерилизация полимерных матриц на основе поли(Ь-лактида)

2.6. Исследование методов посева и культивирования мезенхимных стволовых клеток жировой ткани крысы на матрице из поли(Ь-лактида)

2.7. Исследование разработанных полимерных матриц в хронических экспериментах in vivo

2.8 Морфологическое исследование полученных эксплантатов

2.9. Статистический анализ

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ МАТРИЦ НА ОСНОВЕ ПОЛИ(Ь-ЛАКТИДА) И ОЦЕНКА ИХ ФИЗИКО-МЕХАНИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК, БЕЗОПАСНОСТИ И БИОСОВМЕСТИМОСТИ

3.1. Результаты исследования структуры биодеградируемой полимерной матрицы

3.2 Результаты кристаллизации полимерной матрицы из поли^-лактида)

3.3 Результаты изучения физических свойств полимерных матриц

3.4 Результаты оценки биосовместимости полимерной матрицы на основе поли(Ь-лактида)

3.6 Обсуждение результатов разработки и оценки физико-механических характеристик, безопасности и биосовместимости биодеградируемых матриц на основе поли(Ъ-лактида)

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТОДОВ ПОСЕВА И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ НА МАТРИЦЕ ИЗ ПОЛИ(Ь-ЛАКТИДА)

4.1. Определение оптимального метода посева мезенхимных стволовых клеток жировой ткани на матрицу из поли(Ь-лактида)

4.2 Изучение времени адгезии мезенхимных стволовых клеток жировой ткани к матрице из поли(Ь-лактида) при фильтрационном посеве

4.3 Определение оптимального количества мезенхимных стволовых клеток жировой ткани для посева на единицу длины матрицы из поли(Ь-лактида)

4.4 Определение оптимального метода культивирования мезенхимных стволовых клеток жировой ткани на матрице из поли(Ь-лактида)

4.5 Обсуждение результатов определения оптимального метода посева и способа культивирования мезенхимных стволовых клеток жировой ткани на матрице из поли(Ь-лактида)

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕЗОРБЦИИ МАТРИЦ И ОБРАЗОВАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОГО СОСУДИСТОГО ИМПЛАНТАТА В ХРОНИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO

5.1 Исследование реакции окружающих тканей и процессов биодеградации трубчатой полимерной матрицы из поли(Ь-лактида) в мышечной ткани

5.2 Реконструкция брюшной аорты животного (крысы) матрицей на основе поли(Ь-лактида), исследование процессов ее резорбции и образования тканей

novo в структуре имплантата

5.3 Обсуждение результатов изучения резорбции матриц и образования тканеинженерного сосудистого имплантата в хронических экспериментах in vivo

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПЕРСПЕКТИВЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Список литературы

Каркас (матрица) для создания тканеинженерного сосудистого имплантата
В настоящее время выделяют три основных направления поиска оптимального каркаса для разработки ТИСИ первое заключается в использовании нативных человеческих белков, второе синтетических резорбируемых полимеров. Отдельным направлением является использование в качестве матрицы децеллюляризированных графтов.
Основатели этой методики Weinberg C.B., Bell E. в 1986 году сконструировали графт, средний слой которого был выполнен из гидрогеля коллагена и бычьих ГМК, наружный из ФБ и коллагена, внутренняя поверхность была засеяна ЭК [260]. Однако, низкие механические свойства полученной трубки не позволили использовать ее в качестве сосудистого протеза. В последующие годы выполнен ряд работ, в которых пытались исправить описанный недостаток этой технологии, однако и они не увенчались успехом [116, 191, 192, 267]. В опытах на животных полученные конструкции укрепляли синтетическими материалами [112, 246]. При использовании только нативного каркаса происходила дилатация графтов или аневризматическая трансформация [213].
Метод применения гидрогелей из разнообразных естественных белков и их комбинаций позволяет синтезировать графт только из естественных компонентов сосудистой стенки без применения синтетических материалов. Также возможно заселение таких конструкций клетками на этапе их разработки, что может способствовать внедрению клеток и их взаимодействию с внеклеточным матриксом. Таким образом, существует возможность влиять на дальнейшую дифференцировку клеточного материала и на ремоделирование всей конструкции. Однако, механические свойства таких моделей остаются неудовлетворительными.
В случае использования каркасов из биоразлагаемых полимеров стенка нового сосуда формируется на фоне двух параллельно протекающих процессов: деградации полимера и возникновения нового матрикса. В итоге элементы каркаса полностью исчезают, и всю нагрузку берет на себя вновь образованная стенка графта. Таким образом, структура матрицы должна способствовать адгезии и пролиферации клеток. Таков принцип методики, однако, добиться баланса двух параллельных процессов на практике оказалось непросто.
В сравнении с использованием естественных белков, создание синтетических биополимеров проще и дешевле. Изменяя структуру, состав и метод получения, можно модифицировать скорость деградации, биосовместимость, эластичность и другие параметры биополимера. Биосовместимость получаемых в таких случаях графтов может быть улучшена с помощью модификации их внутренней поверхности химическими и физическими методами [97, 107, 194]. Однако, для всестороннего изучения биополимеров, в том числе возможного токсического воздействия продуктов биодеградации необходимо проведение долгосрочных опытов.
Таким образом, к основным достоинствам матриц из деградируемых биополимеров следует отнести их воспроизводимость с заданными параметрами, такими как диаметр, толщина стенки, скорость деградации, пористость и размер пор, биосовместимость, высокие механические свойства.
Для создания полимерной биодеградируемой матрицы применяют: поли(L-лактид) (ПЛА) [186], сополимер молочной и гликолевой кислот [209], полигидроксибутират (ПГБ) [234], сополимер полигликолевой кислоты и полигидроксиалканоата [235], полиглактин [178], полидиоксанон [118] и др. Основные характеристики этих полимеров приведены в Таблице 1.
Наиболее перспективным представляется использование ПЛА. Отдельно или в составе сополимеров ПЛА является наиболее широко используемыми биодеградируемым синтетическим полимером в медицине. Скорость деградации определяется исходным молекулярным весом, суммарной площадью поверхности полимера и кристалличностью. ПЛА является универсальным биорассасывающимся биоматериалом с отличными механическими свойствами. Он сравнительно медленно деградирует с образованием нетоксичных мономеров молочной кислоты, которые элиминируются макрофагами и гигантскими клетками инородных тел. В ряде долгосрочных клинических исследований коронарных биодеградируемых стентов доказана безопасность и возможность использования полимера [49].
Электроспининг — методика синтеза микро- и нановолокон из раствора биополимера на приемном вращающемся стержне под действием электростатических сил, создаваемых источником высокого напряжения (Рисунок 4) [95, 149, 265]. Моделирование толщины и ориентации волокон, размеров пор осуществляется изменением параметров раствора полимера, электрического поля и скорости вращения стержня [57, 79].
Исследование разработанных полимерных матриц в хронических экспериментах in vivo
Выполнено две серии опытов по имплантации разработанных полимерных матриц в организм животного. В первой ПЛА матрицы помещали в мышечную ткань крысы. Во второй выполняли протезирование брюшной аорты крыс.
Все операции проводили с использованием стерильных инструментов в асептических условиях в операционной лаборатории инвазивных технологий научно-исследовательского центра ПСПбГМУ им. ак. И.П. Павлова. Оперированы самцы крысы весом 200 - 250 гр. одной генетической линии. Предоперационная подготовка заключалась в депривации от корма за 12 часов до операции. Крысу располагали на подогреваемом коврике (37о С, ATC1000, World Precision Instruments, США) в положении на животе (1 серия опытов) или на спине (2 серия опытов). Производили бритье операционного поля и его трехкратную обработку спиртосодержащим раствором (Erisan, Финляндия).
Все опыты выполняли на самцах крыс породы Вистар (питомник «Рапполово» РАМН, г. Санкт-Петербург). Животные находились в отдельных клетках со стандартным суточным режимом, имели свободный доступ к воде и корму. Уход и наблюдение за животными выполняли в соответствии с требованиями приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г. No 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Выполнение исследования разрешено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. При проведении экспериментальных исследований также руководствовались требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., №267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных”, принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986г.) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996г.).
Анестезиологическое пособие выполняемых операций осуществлялось внутрибрюшинным введением препаратов «Рометар» и «Золетил-100», с предварительной премедекацией подкожным введением атропина сульфата (Таблица 2). Длительность анестезии и хирургических манипуляций составила 60-90 минут. Уровень анестезии контролировали посредством тестирования роговичного рефлекса каждые 15 минут. Для предотвращения дегидратации во время операции использовали внутрибрюшинное введение растворов кристаллоидов. Наблюдение за всеми анестезированными животными проводили до тех пор, пока полностью не завершалось действие анестетика.
Животные находились в специальной зоне до тех пор, пока действие анестетиков полностью не заканчивалось. Послеоперационный уход обеспечивал все необходимые условия для скорейшего выведения из наркоза и заживления ран введение жидкостей, анальгетиков, уход за послеоперационной раной. Выведение из наркоза: каждые 15 минут после окончания операции у животных оценивали роговичный рефлекс и измеряли ЧДД, ЧСС.
В послеоперационном периоде осуществляли уход за животными, осматривая их каждые 2 сут. Лечение и профилактику болевого синдрома проводили введением стандартных доз анальгетиков (анальгин (метамизол натрия), 400 мг/кг, ip) с обязательной оценкой критериев послеоперационной боли (Таблица 3). Для профилактики инфекционных осложнений выполняли обработку ран раствором антисептика «Ахдез» (Петроспирт, Россия) каждые 2 сут до заживления.
Для оценки процессов биорезорбции, безопасности и биосовместимости ПЛА матрицы выполняли ее имплантацию в мышечную ткань крысы. В этой серии опытов использованы два типа ПЛА матрицы: исходная аморфная и кристаллизованная в фиксированном состоянии. Сроки наблюдения 6, 13 и 15 месяцев. Прооперировано двенадцать животных: на каждом сроке наблюдения выводили из опыта по две крысы для каждого типа материала.
В проекции m. spinotrapezius выполняли продольный 2 см разрез кожи и подкожно-жировой клетчатки, разводили пучки указанной мышцы и имплантировали трубчатую матрицу длиной 1 см с фиксацией к мышце нитью пролен 8-0 (W2970, Ethilon, Ethicon, США). Далее выполняли послойный шов раны.
Производили осмотр зоны ранее выполненного оперативного вмешательства. Доступом по старому послеоперационному рубцу выделяли ПЛА матрицу, ориентиром служила нить пролен 8-0 (W2970, Ethilon, Ethicon, США). Графт иссекали вместе с окружающими тканями и препарат фиксировали в растворе 10 % забуференного формалина.
В хронических экспериментах in vivo изучены три типа полимерных матриц. В группе №1 (термообработанная в фиксированном состоянии матрица из ПЛА) прооперировано 36 животных, сроки наблюдения 2 суток и 1, 2, 4, 12, 24, 48, 56, 64 недели. В группе № 2 (комбинированная матрица из ПЛА и ФПЛ-32) оперировано 36 животных, сроки наблюдения 2 суток и 1, 2, 4, 12, 24, 48, 56, 64 недели. В группе № 3 (матрица из ПЛА с культивированными МСК ЖТ в проточном биореакторе) оперировано 24 животных, сроки наблюдения 2 суток и 1, 2, 4, 12, 24 недели. В представленных трех группах для каждого срока наблюдения прооперировано 4 животных.
Трекинг культивированных на матрице МСК ЖТ осуществляли с использованием липофильной метки РКН-26 у шести животных. Сроки наблюдения 2, 7 и 14 суток. Для этого мембраны клеток in vitro метили прижизненным флуоресцентным красителем PKH-26 согласно протоколу фирмы-производителя (Sigma, США). После эксплантации графтов с меченными клетками производили флуоресцентную микроскопию в красном спектре. Количество клеток видимых в красном диапазоне соответствовало числу МСК ЖТ в матрице. Также выполняли окраску ядер всех клеток в стенке матрицы красителем DAPI по описанной выше методике. Препараты анализировали в синем спектре.