Создание и характеристика иммуногена на основе белков VP6 и VP8 ротавируса группы А Богомолова Елена Григорьевна

Краткое описание

Богомолова,ЕленаГригорьевна.СозданиеихарактеристикаиммуногенанаосновебелковVP6иVP8ротавирусагруппыА: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.04 /БогомоловаЕленаГригорьевна; [Место защиты: ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»]. - Санкт-Петербург, 2019. - 228 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» На правах рукописиБОГОМОЛОВАЕленаГригорьевнаСОЗДАНИЕИХАРАКТЕРИСТИКАИММУНОГЕНАНАОСНОВЕБЕЛКОВVP6ИVP8РОТАВИРУСАГРУППЫА 03.01.04 Биохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических

стр. 8
рекомбинантных вакцин наосновеполноразмерных ротавирусныхбелков, а также их частей. Среди капсидныхбелковротавирусагруппыА наиболее важнымииммуногенамислужатбелкиVP6иVP8.БелокVP8является N-концевым триптическим фрагментомбелканаружного капсида VP4. Данныйбелок(VP8) является высокоиммуногенным

стр. 9
Цель и задачи исследования Цель настоящего исследования заключалась всозданиии биохимическойхарактеристикеиммуногенанаосновебелковVP6иVP8ротавирусагруппыА. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1. Моделирование структуры гибридныхбелковVP6VP8 и FliCVP6VP8

Оглавление диссертациикандидат наук Богомолова Елена Григорьевна
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Характеристика ротавируса
1.2 Эпидемиология ротавирусной инфекции
1.3 Патогенез ротавирусной инфекции
1.4 Профилактика ротавирусной инфекции
1.4.1 Живые аттенуированные противоротавирусные вакцины
1.4.2 Кандидатные вакцины на основе инактивированных ротавирусов
1.4.3 Кандидатные противоротавирусные вакцины на основе рекомбинантных белков
1.5 Белковые адъюванты
1.5.1 Флагеллин бактерии рода Salmonella
1.5.2 CRM197 - нетоксичный вариант дифтерийного токсина
1.6 Гибридные белки, содержащие фрагменты белков капсида VP6, VP8 ротавируса группы А в качестве активного агента кандидатной вакцины для профилактики ротавирусной инфекции ........................................................................................................................................... 52!
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Плазмидная ДНК pET-28a(+)
2.2 Бактериальные штаммы
2.3 Штаммы вируса
2.4 Лабораторные животные
2.5 Реакции ферментативной модификации ДНК
2.5.1 Синтез последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8
2.5.2 Амплификация генов vp6vp8 и flicvp6vp8
2.5.3 Рестрикция плазмидной ДНК
2.5.4 Лигирование фрагментов плазмидной ДНК
2.6 Микробиологические методы ................................................................................................... 60!
2.6.1 Приготовление компетентных клеток E.coli для трансформации
2.6.2 Трансформация бактериальных клеток
2.6.3 Скрининг рекомбинантных клонов на наличие требуемой плазмидной ДНК
2.6.4 Индукция экспрессии генов, кодирующих гибридные рекомбинантные белки, в штамме-продуценте ИПТГ
2.6.5 Автоиндукция экспрессии 0,2% лактозой по методу Штудиера
2.7 Анализ и очистка нуклеиновых кислот
2.7.1 Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле
2.7.2 Препаративный электрофорез ДНК и выделение ДНК из агарозного геля
2.7.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
2.7.4 Секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК по методу Сенджера
2.8 Анализ и очистка рекомбинантных белков
2.8.1 Электрофорез белков в денатурирующих условиях по Леммли
2.8.2 Определение концентрации белка по методу Лоури
2.8.3 Получение и отмывка телец включения
2.8.4 Иммобилизованная металлоаффинная хроматография
2.8.5 Гель-фильтрация
2.8.6 Определение остаточных белков штамма-продуцента
2.8.7 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента
2.8.8 Определение остаточных эндотоксинов
2.8.9 Расчет алифатического индекса
2.8.10 Western-blotting
2.8.11 Масс-спектрометрический анализ
2.9 Иммунологические методы
2.9.1 Определение иммуногенных свойств рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
2.9.2 Определение титра антител в сыворотках иммунизированных животных
2.9.3 Определение титра антител к антигенам ротавируса в сыворотках крови иммунизированных животных
2.9.4 Реакция нейтрализации вируса в культуре клеток
2.9.5 Исследование иммуногенности FliCVP6VP8 при внутримышечном введении совместно с адъювантом CRM197
2.9.6 Исследование протективности иммуногена FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo
2.9.7 Определение ротавирусного антигена методом иммуноферментного анализа
2.9.8 Исследование протективности иммуногена FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo
2.10 Статистический анализ полученных результатов
2.11 Компьютерные методы анализа данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Получение белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.1.1 Моделирование белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.1.2 Создание нуклеотидных последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8
3.1.3 Создание и анализ плазмидных ДНКpET-28a(+)-vp6vp8 и pET-28a(+)-flicvp6vp8 и штаммов E.coli для их амплификации
3.1.4 Создание штаммов-продуцентов гибридных белковVP6VP8 и FliCVP6VP8
3.1.5 Индукция экспрессии гибридных генов vp6vp8 и flicvp6vp8 и оценка локализации гибридных белков в клетках штаммов-продуцентов
3.1.6 Очистка гибридных рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.1.7 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.1.8 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.1.9 Определение остаточного белка штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.1.10 Определение остаточных эндотоксинов штамма-продуцента в образцах рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.2 Получение и характеристика рекомбинантного белка CRM197
3.2.1 Расчет алифатического индекса и индекса GRAVY для рекомбинантного белка CRM197
3.2.2 Индукция экспрессии гена, кодирующего рекомбинантный CRM97
3.2.3 Очистка рекомбинантного белка CRM197 с использованием металлоаффинной хроматографии
3.2.4 Диализ препарата высокоочищенного белка CRM197
3.2.5 Определение подлинности рекомбинантного белка CRM197
3.2.6 Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного белка CRM197
3.2.7 Определение остаточных белков штамма-продуцента
3.2.8 Определение остаточной ДНК штамма-продуцента
3.2.9 Определение содержания бактериального липополисахарида
3.3 Результаты исследования рекомбинантных белков VP6VP8 и FHCVP6VP8 в экспериментах in vivo и in vitro
3.3.1 Иммуногенная активность рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.3.2 Определение титра антител кротавирусам в сыворотках животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.3.3 Вируснейтрализующая активность сывороток животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8
3.3.4 Определение иммуногенности FliCVP6VP8 при внутримышечном введении совместно с адъювантом CRM197
3.3.5 Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo
3.3.6 Протективные свойства рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Введение
4.2 Получение рекомбинантных белков VP6VP8 и FHCVP6VP8
4.2.1 Молекулярный дизайн и клонирование последовательностей генов vp6vp8 и flicvp6vp8 в плазмиде pET-28a(+)
4.2.2 Динамика биосинтеза рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 в клетках E.coli
4.2.3 Очистка гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8 с помощью металлоаффинной хроматографии и гель-фильтрации
4.2.4 Контроль качества полученных образцов рекомбинантных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
4.3 Получение и характеристика рекомбинантного белка-адъюванта CRM197
4.4 Анализ результатов, полученных при изучении рекомбинантных белков VP6VP8 и FHCVP6VP8 в экспериментах in vivo и in vitro
4.4.1 Иммуногенные свойства гибридных белков VP6VP8 и FliCVP6VP8
4.4.2 Титр антител кротавирусам в сыворотках животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8
4.4.3 Вируснейтрализующая активность сывороток животных, иммунизированных белками VP6VP8 и FliCVP6VP8
4.4.4 Анализ протективных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при внутримышечном введении в экспериментах in vivo
4.4.5 Анализ протективных свойств рекомбинантного белка FliCVP6VP8 при интраназальном введении в экспериментах in vivo
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
ВВЕДЕНИЕ