Создание коллекции инсерционных мутантов и идентификация генов, контролирующих морфогенез у Arabidopsis thaliana Томилова, Наталья Борисовна

Краткое описание

Томилова,НатальяБорисовна.Созданиеколлекцииинсерционныхмутантовиидентификациягенов,контролирующихморфогенезуArabidopsisthaliana: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.15. - Москва, 2000. - 245 с. : ил.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И.ВАВИЛОВА На правах рукописи УДК:575.11:582.232.7:581.132:577.113:579.254ТОМИЛОВАНатальяБорисовнаСозданиеколлекцииинсерционныхмутантовиидентификациягенов,контролирующихморфогенезуArabidopsisthaliana. ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой

стр. 96
и обсуждение. 4.1.Созданиемутантов. Процессколлекциисозданияморфологических морфологическихинсерционныхинсерционныхколлекциимутантоввключал в себя два основных этапа. Первый этап заключался всозданииколлекциитрансгенных растений,геномклеток которых содержал инсерции Т - ДНК, и затем,

стр. 153
Летальные проростки'^Мутантыизмененного размера^^ Эмбриональные леталиМутантысо сниженной фертильностью стерильныеМутантыпигментации: желто-зеленые альбиносыМутантыс измененными органами: цветковыемутантыкорневыемутанты^^мутантытрихом/опушениямутантылистьев/семядолей другие:мутантыгипокотиля

Оглавление диссертациикандидат биологических наук Томилова, Наталья Борисовна
1 Введение
2 Обзор литературы.
2.1 Методология исследования структурно - функциональной организации генома у высших растений
2.1.1 Состояние проблемы
2.1.2 Установление связи между структурой и функцией генов
2.1.3 Прямая и обратная генетика
2.2 Инсерционный мутагенез
2.2.1 Использование транспозонов для инсерционного мутагенеза растений
2.2.2 Использование Т-ДНК для инсерционного мутагенеза растений
2.3 АгаЫйор$1$ ИгаИапа как модельный объект молекулярно генетических исследований
2.3.1 Организация генома и общие физиологические характеристики развития
2.3.2 Оценка количества независимых инсерций, необходимых для «насыщения» генома А. ЛаИапа
2.3.3 Коллекции трансгенных растений
2.3.4 Морфологические мутанты
2.3.4.1 Фитогормоны
2.3.4.1.1 Общая характеристика и классификация
2.3.4.1.2 Характеристика «гормональных» мутантов
2.3.4.2 Регуляторные системы А. ЙшНапа
2.3.4.2.1 Общие характеристики регуляторных элементов
2.3.4.2.2 Семейство MYB - подобных элементов
2.3.4.2.3 Белки, содержащие F - box
2.4 Использование методов компьютерного анализа для идентификации генов и оценки функции их продуктов
2.4.1 Национальный центр биотехнологической информации (NCBI
2.4.2 Компьютерные программы и базы данных для структурно -функционального анализа генома A. thaliana
2.5 Итоги
3 Материалы и методы.
3.1 Генетический материал
3.2 Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе
3.3 Среды, использованные в работе
3 .3.1 Среды для культивирования бактерий
3.3.2 Среды для культивирования растений Л thaliana
3.3.3 Антибиотики, использованные в работе
3.4 Поверхностная стерилизация семян A thaliana
3.5 Культивирование растений A. thaliana в стерильных условиях
3.6 Агробактериальная трансформация A. thaliana
3.7 Отбор трансформантов в Т2 поколении
3.8 Трансформация штаммов Е. coli
3.9 Трансформация A. tumefaciens
3.10 Ведение асептических культур тканей растений Л. thaliana и спасение летальных мутантных форм
3.11 Гистохимическое определение экспрессии ß - глюкуронидазы тканях растений А. thaliana
3.12 Выделение геномной ДНК из тканей А. thaliana для ПЦР
3.13 Выделение ДНК из тканей A. thaliana для клонирования и блот -гибридизации
3.14 Выделение плазмидной ДНК из клеток бактерий
3.15 Препаративное выделение плазмидной ДНК из штаммов Е. coli тепловым методом
3.16 Очистка ДНК от примесей белков
3.17 Освобождение от РНК
3.18 Хроматографическая очистка ДНК
3.19 Очистка ДНК при помощи электрофореза
3.20 Лигирование по тупым концам ДНК ПЦР - фрагмента в векторную плазмиду pGEM7Zf
3.21 Блот - гибридизация по Саузерну
3.22 Тестирование ДНК растений при помощи ПЦР
3.23 Скрининг бактериальных колоний
3.24 ПЦР - амплификация области геномной ДНК Л. thaliana, примыкающей к Т - ДНК инсерции
3.24.1 Метод «TAIL» - ПЦР
3.25 Секвенирование ДНК
3.26 Сегрегационный анализ растений
4 Результаты и обсуждение
4.1 Создание коллекции морфологических инсерционных мутантов
4.1.1 Создание коллекции трансгенных растений
4.1.1.1 Характеристика векторов
4.1.1.2 Отбор трансгенных растений, полученных с использованием вектора pLD
4.1.1.2.1 Отбор по генетическим маркерам Т - области
4.1.1.2.2 Определение числа Т - ДНК инсерций в геноме отобранных растений методом блот - гибридизации по Саузерну
4.1.1.3 Отбор трансгенных растений, полученных с использованием вектора рРСУЮМ
4.1.1.4 Коллекция трансгенных растений
4.1.2 Отбор фенотипически регистрируемых мутантов
4.1.2.1 Морфологически измененные мутантные линии растений, отобранные в Т2 поколении
4.1.2.1.1 Фертильные растения
4.1.2.1.2 Растения со сниженной фертильностью
4.1.2.1.3 Стерильные растения
4.1.2.1.4 Итоги анализа растений, отобранных в Т2 поколении
4.1.2.2 Линии растений, отобранные в ТЗ поколении
4.1.2.3 Использование гормонов для спасения летальных мутантов
4.1.2.3.1 Подбор гормональных сред для спасения летальных проростков
4.1.2.3.1.1 Индукция и формирование каллуса
4.1.2.3.1.2 Индукция корней
4.1.2.3.2 Спасение летальных проростков, выщепляющихся в ТЗ поколении растений
4.1.2.4 Классификация полученных мутантных линий по фенотипу
4.1.2.5 Итоги анализа отобранных морфологических мутантов
4.2. Идентификация гена, мутация в котором обуславливает возникновение некрозов семядолей при развитии проростков А. ИгаЫапа
4.2.1 Мутант с некрозами семядолей А. (ИаНапа
4.2.1.1 Кинетика развития визуально регистрируемых мутантов
4.2.1.2 Сниженная жизнеспособность визуально регистрируемых мутантов
4.2.2 Анализ расщепления по фенотипу в четвертом после трансформации
Т4) поколении растений линии
4.2.3 Косегрегационный анализ
4.2.4 Амплификация участка геномной ДНК мутанта 137, прилегающего к Т-ДНК инсерции
4.2.5 Клонирование амплифицированного фрагмента ДНК
4.2.6 Определение нуклеотидной последовательности ДНК амплифицированного фрагмента
4.2.7 Компьютерный анализ полученных данных
4.2.7.1 Локализация мутантного гена
4.2.7.2 Анализ структурно-функциональной организации последовательности ДНК A. thaliana вблизи сайта интеграции
Т - ДНК
4.2.7.3 Анализ возможного механизма действия пептида, кодируемого ОРС
5 Выводы