Структурно-функциональные основы уникальной специфичности энтеропептидазы Лихарева, Виктория Владимировна

Краткое описание

Лихарева,ВикторияВладимировна.Структурно-функциональныеосновыуникальнойспецифичностиэнтеропептидазы: диссертация ... кандидата химических наук : 03.00.04. - Москва, 2005. - 132 с.больше
Цитаты из текста:

стр. 1
Ю.А.ОВЧИННИКОВА На правах рукописиЛихареваВикторияВладимировнаСтруктурно-функциональныеосновыуникальнойспецифичностиэнтеропептидазы03.00.04.-БИОХИМИЯ

стр. 2
1. Структура и иерархия су'бстрат-связывающих центровэнтеропептидазы1.1 Первичная и вторичнаяспецифичностьэнтеропептидазыв сравнении с трипсином 1.1.1. Первичнаяспецифичность1.1.2. Вторичнаяспецифичность1.2. 1.2. ЭффективностьэнтеропептидазыМодификация трипсина и трипсиногена для обнаружения

стр. 38
иерархия субстрат-связывающих центровэнтеропептидазы1.1. Первичная и вторичнаяспецифичностьэнтеропептидазыв сравнении с трипсином Для анализа первичной и вторичнойспецифичностиэнтеропептидазыпроведено исследование гидролиза нескольких серий синтетических модельных субстратов (табл. 5). Условно, субстраты

Оглавление диссертациикандидат химических наук Лихарева, Виктория Владимировна
Список сокращений
Введение 6 I. Литературный обзор
1.1. Локализация энтеропептидазы
1.2. Структура энтеропептидазы
1.3. Активация проэнтеропептидазы
1.4. Трипсиноген - физиологический субстрат энтеропептидазы 14 1.4.1 Структурные модификации в процессе активации трипсиногена
1.5. Специфичность энтеропептидазы
1.6. Использование энтеропептидазы для процессинга химерных белков
1.7. Вторичная специфичность сериновых протеиназ
1.8. "Энтеропептидазный линкер" -(Asp)4Lys- в составе природных ' белков
1.9. Роль ионов кальция в энтеропептидазном катализе
1.9.1. Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы
1.9.2. Эффект ионов кальция на энтеропептидазный гидролиз 32 II. Результаты и обсуждение
Глава 1. Структура и иерархия су'бстрат-связывающих центров энтеропептидазы 38 1.1 Первичная и вторичная специфичность энтеропептидазы в сравнении с трипсином
1.1.1. Первичная специфичность
1.1.2. Вторичная специфичность 41 1.2. Эффективность энтеропептидазы 51 1.2.1. Субстрат Z-Lys-S-Bzl 54 1.2. Модификация трипсина и трипсиногена для обнаружения доменов субстрата, взаимодействующих с SII-центром энтеропептидазы
1.2.2.1. ДФФ-трипсин
1.2.2.2. Ацетилированный трипсиноген
Глава 2. Особенности энтеропептидазного катализа
2.1. Лимитирующая стадия
2.2. Эффект ионов кальция
Глава 3. Пептидные субстраты как модели природных и искусственных белковых субстратов энтеропептидазы.
Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы
3.1. Гидролиз "неспецифических"субстратов энтеропептидазы как модель автолиза
3.2. N-концевые пептиды мутантных катионных трипсиногенов человека K23R и D22G
3.3. "Неспецифический" энтеропептидазный гидролиз белков
3.4. Потенциальные и экспериментально обнаруженные центры автолиза энтеропептидазы
3.5. Физиологическая роль кальций-зависимого автолиза трипсина и тяжелой цепи энтеропептидазы
III. Экспериментальная часть
1. Материалы
2. Методы
2.1. Очистка энтеропептидазы
2.2. Определение белка
2.3. Определение активности энтеропептидазы
2.4. Определение активности трипсина
2.5. Определение кинетических параметров гидролиза синтетических субстратов 10*
2.5.1. Определение кинетических параметров гидролиза Z-Lys-S-Bzl
2.5.2. Определение кинетических параметров гидролиза модельных пептидов
2.6. Изучения влияния ионов кальция на эффективность энтеропептидазного гидролиза
2.7. Определение лимитирующей стадии реакции " гидролиза ряда синтетических субстратов энтеропептидазой
2.8. Получение апо-формы полноразмерной энтеропептидазы и ее укороченной формы
2.9. Получение ДФФ-трипсина
2.10. Получение ацетилированного трипсиногена
2.10.1. Определение влияния ацетилированного трипсиногена на процесс активации трипсиногена энтеропептидазой
2.10.2. Определение влияния ацетилированного трипсиногена на гидролиз GD4K-Nfa энтеропептидазой
2.11. Гель-электрофорез
2.12. Масс-спектрометрический анализ 114 Выводы 115 Список литературы
Список сокращений
BAPNA - а-Л^-бензоил-£>£-аргинин 4-нитроанилид; BPTI - основной панкреатический трипсиновый ингибитор быка; GD4K-Nfa - /?-нафтиламид глицил-тетра-£-аспартил-/,-лизина; Gdn-Bz-OMum - 4'-гуанидинобензоат 4-метилумбеллифериловый эфир; Gdn-Bz-ONp - 4'-гуанидинобензоат 4-нитрофениловый эфир; GPCR - суперсемейство интегральных семидоменных мембранных рецепторов, сопряженных с G-белками;
HEPES - Лг-2-гидрокси-этилпиперазин-Лг-этансульфоновая кислота;
OG - «-октил-/?-£>-глюкопиранозид;
ОМе - метиловый эфир;
PAR - активируемый протеиназой рецептор;
PrA-D4K-P26 - химерный белок, содержащий в качестве носителя модифицированный белок А, а в качестве целевого продукта - рековерин; STI - ингибитор трипсина из бобов сои; TFA - трифторуксусная кислота; TLCK - УУ-тозил-Х-лизин хлорметилкетон; Tris - трис(гидроксиметил)аминометан;
Z-Lys-S-Bzl - тиобензиловый эфир а-//-бензоилоксикарбонил-1-лизина;
ДМСО - диметилсульфоксид;
ДТДП - 4,4'-дитиодипиридин;
ДФФ - диизопропилфторфосфат;
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат.