Структурные исследования компонентов теломеразного комплекса дрожжей Hansenula polymorpha Петрова Ольга Алексеевна

Краткое описание

Петрова, Ольга Алексеевна.
Структурные исследования компонентов теломеразного комплекса дрожжей Hansenula polymorpha : диссертация ... кандидата химических наук : 02.00.10; 03.01.03 / Петрова Ольга Алексеевна; [Место защиты: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова]. - Москва, 2018. - 167 с. : ил.
Оглавление диссертациикандидат наук Петрова Ольга Алексеевна
Список сокращений
1. Введение
2. Обзор литературы. Структура и функция теломеразы
2.1 Основные компоненты теломеразы
2.1.1 Теломеразная обратная транскриптаза (TERT)
2.1.1.1 TERT ring
2.1.1.2 TEN домен TERT
2.1.1.3 TRBD домен TERT
2.1.1.4 RT домен TERT
2.1.1.5 CTE домен TERT
Выводы из раздела
2.1.2 Теломеразная РНК
2.1.2.1 Матричный участок
2.1.2.2 TBE элемент
2.1.2.3 Псевдоузел
2.1.2.4 STE элемент
2.1.2.5 Сайты связывания ассоциированных белков
Выводы из раздела
2.2 Дополнительные компоненты теломеразы
2.2.1 Структура дополнительных компонентов теломеразного комплекса реснитчатых
2.2.2 Структура дополнительных компонентов теломеразного комплекса человека
2.2.3 Структура дополнительных компонентов теломеразного комплекса дрожжей
2.2.3.1 CDC13
2.2.3.2 Est1
2.2.3.3 Est3
2.3 Заключение обзора литературы
3. Результаты и их обсуждение
3.1 Постановка задачи
3.2 Идентификация генов дополнительных белковых компонентов теломеразы дрожжей H.polymorpha
3.2.1 Биоинформатическая идентификация гена белка hpEst1
3.2.2 Экспериментальное подтверждение взаимосвязи гена-кандидата белка hpEst1 и системы поддержания длины теломер
3.2.3 Биоинформатическая идентификация гена белка hpEst3
3.2.4 Экспериментальное подтверждение взаимосвязи гена-кандидата белка hpEst3 и системы поддержания длины теломер
3.3 Разработка метода выделения белков hpEst1 и hpEst3, пригодных для структурных и функциональных исследований
3.4 Структурные исследования белка hpEst3
3.5 Поиск границ доменов каталитической субъединицы дрожжей H.polymorpha (hpTERT)
3.5.1 Биоинформатический анализ последовательности hpTERT
3.5.2 Разработка метода выделения доменов hpTERT, пригодных для структурных исследований
3.6 Структурные исследования N-концевого домена hpTERT (hpTEN)89
3.6.1 Структурные исследования hpTEN методом кристаллографии
3.6.2 Структурные исследования hpTEN методом спектроскопии ЯМР
3.6.3 Сравнение структур hpTEN, полученных методом ЯМР спектроскопии и кристаллографии
3.6.4 Сравнение структур hpTEN и ttTEN
3.6.5 Взаимодействие hpTEN с нуклеиновыми кислотами
3.6.6 Предположительная роль TEN домена в работе теломеразы
3.7 Заключение
4. Выводы
5. Материалы и методы
5.1 Реактивы, буферные растворы, штаммы и биопрепараты
5.2 Методики, использованные в работе
5.2.1 Клонирование
5.2.1.1 ПЦР
5.2.1.2 Выделение плазмидной ДНК
5.2.1.3 Приготовление векторов и вставок
5.2.1.4 Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле
5.2.1.5 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
5.2.1.6 Лигирование
5.2.2 Приготовление компетентных клеток E. coli
5.2.3 Трансформация компетентных клеток E. coli
5.2.4 Секвенирование плазмид
5.2.5 Клонирование генов hpEst1, hpEst3 и hpTEN в экспрессионный вектор
5.2.6 Получение штаммов дрожжей H.polymorpha, «нокаутных» по генам Est1 и Est3
5.2.6.1 Получение кассет для трансформации дрожжей
5.2.6.2 Трансформация клеток H. polymorpha
5.2.7 Выделение геномной ДНК H.polymorpha
5.2.8 Саузерн-блот анализ рестрикционных фрагментов теломер
5.2.8.1 Получение и разделение рестрикционных фрагментов теломер
5.2.8.2 Перенос ДНК на нитроцеллюлозную мембрану
5.2.8.3 Приготовление зондов для гибридизации
5.2.8.4 Гибридизация мембраны с зондами
5.2.9 Проверка сенессенс фенотипа штамма с нокаутом гена-кандидата методом разведения на чашках Петри
5.2.10 Выделение и очистка рекомбинантных белков hpEst1, hpEst3,
hpTEN
5.2.10.1 Первая стадия очистки белков металл-хелатной хроматографией
5.2.10.2 Протеолитическое удаление аффинного тага
5.2.10.3 Гель-фильтрация
5.2.11 Проведение полиакриламидного гель-электрофореза и проверка экспрессии белка hpEst1 методом Вестерн-блот
5.2.12 Спектроскопия кругового дихроизма
5.2.13 Термофлюориметрия
5.2.14 Динамическое светорассеяние
5.2.15 Биоинформатический анализ
6. Список литературы
7. Приложение
7.1 Приложение
7.1.1 Результаты динамического светорассеяния (DLS) для очищенного рекомбинантного белка hpEst3
7.1.2 Пример результатов термофлюориметрии (ТФ, TF) для очищенного рекомбинантного белка hpEst3
7.1.3 Результаты измерения кривой кругового дихроизма (КД) для очищенного рекомбинантного белка hpEst3
7.2 Приложение
7.2.1 Результаты динамического светорассеяния (DLS) для очищенных рекомбинантных белков hpN-2, hpN-25, hpTEN
7.2.2 Пример результатов термофлюориметрии (ТФ, TF) для очищенных рекомбинантных белков hpN-2, hpN-25, hpTEN
7.2.3 Результаты измерения кривой кругового дихроизма (КД) для очищенных рекомбинантных белков hpN-2, hpN-25, hpTEN
7.3 Приложение