Світіна Ганна Миколаївна По­рівняльна характеристика мезенхімальних стромальних клі­тин плаценти щура і людини та вплив їх трансплантації на канцерогенез товстої кишки

Краткое описание

Світіна Ганна Миколаївна, тимчасово не працює: «По­рівняльна характеристика мезенхімальних стромальних клі­тин плаценти щура і людини та вплив їх трансплантації на канцерогенез товстої кишки» (03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія). Спецрада Д 26.001.38 у Київському на­ціональному університеті імені Тараса Шевченка

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
Світіна Ганна Миколаївна
УДК: 616-006.04. 602:575.853.576.31
ПОРІВНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ
СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН ПЛАЦЕНТИ ЩУРА І ЛЮДИНИ ТА ВПЛИВ
ЇХ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ НА КАНЦЕРОГЕНЕЗ ТОВСТОЇ КИШКИ
03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія
Дисертація на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Науковий керівник:
доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Гарманчук Людмила Василівна
Київ – 2017
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ ............................................................... 4
ВСТУП .............................................................................................................5
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ.................................................................................... 13
РОЗДІЛ 1. ПЛАЦЕНТА ЯК ДЖЕРЕЛО МУЛЬТИПОТЕНТНИХ
СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН............................................................................. 13
1.1. Поняття мультипотентних стромальних клітин .......................... 13
1.2. Плацента як джерело стовбурових клітин ................................... 14
1.3. Застосування МСК плаценти у доклінічних та клінічних
дослідженнях............................................................................................... 16
РОЗДІЛ 2. КАНЦЕРОГЕНЕЗ ТОВСТОЇ КИШКИ ......................................... 18
2.1. Молекулярні механізми виникнення колоректального раку ....... 18
2.2. Моделювання канцерогенезу товстої кишки............................... 19
2.3. Класифікація пухлин товстої кишки ........................................... 22
РОЗДІЛ 3. ВПЛИВ МСК НА ПРОЦЕСИ КАНЦЕРОГЕНЕЗУ....................... 26
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА............................................................. 30
РОЗДІЛ 4. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ .................................... 30
4.1. Методи роботи з первинними культурами клітин плаценти ....... 30
4.2. Молекулярно-біологічні методи.................................................. 33
4.3. Моделювання канцерогенезу товстої кишки іn vivo та
трансплантація МСКП щура та людини. Схема першого експерименту .... 41
4.4. Моделювання канцерогенезу товстої кишки іn vivo та алогенна
трансплантація МСКП. Схема другого експерименту ................................ 45
4.5. Органне співкультивування......................................................... 50
РОЗДІЛ 5. ХАРАКТЕРИСТИКА МСКП ЩУРА ТА ЛЮДИНИ.................... 53
5.1. Методи отримання МСКП щура та їх характеристика................ 53
5.2. Характеристика МСКП людини.................................................. 60
3
5.3. Порівняльний аналіз МСКПщура та людини .............................. 64
РОЗДІЛ 6. ТРАНСПЛАНТАЦІЯ МСКП ЩУРАМ З ДМГ-ІНДУКОВАНИМ
КАНЦЕРОГЕНЕЗОМ ТОВСТОЇ КИШКИ..................................................... 69
6.1. Вплив МСКП щура і людини на канцерогенез товстої кишки.... 69
6.2. Розподіл та приживлення ксеногенних МСКП в організмі щура 72
РОЗДІЛ 7. АЛОГЕННА ТРАНСПЛАНТАЦІЯ МСКП ЩУРАМ З ДМГІНДУКОВАНИМ КАНЦЕРОГЕНЕЗОМ ТОВСТОЇ КИШКИ........................ 77
7.1. Аналіз канцерогенезу після алогенної трансплантації МСКП .... 77
7.2. Клітинна імунна відповідь у щурів з ДМГ-індукованим раком
товстої кишки після трансплантації МСКП ................................................ 84
7.3. Розподіл алогенних МСКП в організмі щура .............................. 89
7.4. Аналіз виживання тварин............................................................ 90
РОЗДІЛ 8. ОРГАННЕ СПІВКУЛЬТИВУВАННЯ ПУХЛИНИ ТОВСТОЇ
КИШКИ ЩУРА З МСКП ЩУРА................................................................... 96
УЗАГАЛЬНЕННЯ ........................................................................................ 102
ВИСНОВКИ ................................................................................................. 108
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ....................................................... 109
4
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АОМ - азоксометан
АЩС – аутологічна сироватка щурів
ДМГ – диметилгідразин
ЗТ-ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією
КТК – канцерогенез товстої кишки
ЛПС – ліпополісахарид
ММСК – мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини
МСК – мезенхімальні стромальні клітини
МСК КМ – мезенхімальні стромальні клітини кісткового мозку
МСКП – мезенхімальні стромальні клітини плаценти
МСКПл – мезенхімальні стромальні клітини плаценти людини
МСКПщ – мезенхімальні стромальні клітини плаценти щура
НСТ – нітросиній тетразолій
ФБС – фетальна бичача сироватка
ФГА – фітогемаглютінін
ФР – фізіологічний розчин
ФСБ – фосфатно-сольовий буфер
FISH – флуоресцентна in situ гібридизація
5
ВСТУП
Трансплантація мезенхімальних стромальних клітин (МСК) є
перспективним методом лікування багатьох соматичних захворювань [1].
МСК, виділені зі зрілої плаценти (МСКП) людини, відповідають критеріям
International Society for Cellular Therapy [2], при цьому, плацента як джерело
МСК має низку переваг перед іншими джерелами: отримання клітин не
потребує інвазивних втручань, відсутність морально-етичних проблем їх
використання та можливість отримати достатню кількість клітинного
матеріалу.
Дослідження впливу внутрішньовенної трансплантації МСК людини на
перших етапах передбачає введення клітин тваринам, і таким чином, не
враховуються реакції імунної системи на введення ксеногенного біологічного
матеріалу, які можуть змінити результат лікування [3], незважаючи на те, що,
як відомо, МСК можуть уникати розпізнавання аллореактивними Тклітинами та природними клітинами-кілерами [4]. Для більш точного
відтворення процесів необхідно використовувати алогенну трансплантацію
клітин, коли донор і реципієнт належать до одного виду тварин. Також
необхідно відмітити, що МСК виділені з різних джерел мають свої унікальні
особливості, що додатково може вносити зміни на результат системного
введення. Наприклад, залежно від методу виділення МСКП спостерігається
пригнічення або стимулювання проліферативної відповіді Т-лімфоцитів in
vitro [5].
Вплив МСК на розвиток пухлин вивчався з використанням in vitro
співкультивування [6] або моделях ксенотрансплантацій, при яких МСК
людського походження були трансплантовані лабораторним тваринам [7].
Противоречивий ефект МСК на рак може бути пов’язаним із використанням
різних підходів моделювання канцерогенезу, а саме індукування раку
хімічними речовинами [8], трансплантації трансформованих ліній клітин,
6
ксеногенних по відношенню до тварини реципієнта [9]. Крім того, вплив
МСК in vivo в значній мірі була оцінена на основі змін у розмірі або масі
ксенотрансплантованих пухлин в імунодефіцитних реципієнтах, які
відрізняються від людей або тварин зі спонтанним раком. Однак вплив
системного введення МСК на ініціацію та розвиток раку є не достатньо
вивченим.
Колоректальний рак залишається другим за поширеністю раком у
Європі та третім у світі [10]. Симптоми захворювання з’являються вже тоді,
коли пухлина набула великих розмірів, тому лише у 39 % випадках
колоректальний рак діагностується на ранніх стадіях. В інших випадках
прогноз перебігу захворювання залишається несприятливим, 5-річне
виживання досягає лише 11-69 % [11]. Диметилгідразин (ДМГ)-індукована
модель канцерогенезу товстої кишки (КТК) повторює морфологічні та
молекулярні етапи раку товстої кишки у людини на кожному етапі розвитку
пухлини. Під впливом метаболіту ДМГ метилдіазоніуму у колоноцитах
щурів виникають мутації, в проонкогенах, які також спричинюють КТК у
людини: APC, KRAS, TP53, а також мікросателітну нестабільність та
хромосомну нестабільність [12].
Дослідження результатів як ксеногенної, так і алогенної
внутрішньовенної трансплантації мезенхімальних стромальних клітин
плаценти на розвиток спонтанних пухлини товстої кишки стало головною
ідеєю у виконанні дисертаційної роботи.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційну роботу виконано на кафедрі біохімії ННЦ «Інститут біології»
Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках
бюджетної теми «Механізми реалізації адаптаційно – компенсаторних
реакцій організму за умови розвитку різних патологій» ( № д/р 0111U004648,
2011 – 2015 роки), а також бюджетної теми «Альтернативні моделі для
тестування клітинних препаратів на онкогенність» Відділення цільової
7
підготовки Київського національного університету імені Тараса Шевченка
при НАН України (РК № 0114U003877).
Мета дослідження – виділити і охарактеризувати мезенхімальні
стромальні клітини з плаценти людини та щура та оцінити вплив їх
внутрішньовенної трансплантації на розвиток пухлин товстої кишки при
диметилгідразин-індукованому канцерогенезі товстої кишки у щурів.
Завдання:
 Виділити мезенхімальні стромальні клітини плаценти щура та встановити
їх походження;
 Провести порівняльний аналіз характеристик мезенхімальних
стромальних клітини плаценти людини та щура;
 Встановити та порівняти особливості розселення та приживлення
трансплантованих мезенхімальних стромальних клітин плаценти щура та
людини;
 Визначити влив внутрішньовенної трансплантації мезенхімальних
стромальних клітин плаценти людини на індукований канцерогенез
товстої кишки щура;
 Дослідити влив внутрішньовенної алогенної трансплантації
мезенхімальних стромальних клітин плаценти на індукований
канцерогенез товстої кишки щура та зміни деяких показників імунної
системи;
 Вивчити вплив співкультивування мезенхімальних стромальних клітин
плаценти щура на рівень апоптозу та проліферації клітин пухлин товстої
кишки за умов їх органної культури
Об’єкт дослідження – мезенхімальні стромальні клітини плаценти,
диметилгідразин-індукована модель канцерогенезу товстої кишки.
Предмет дослідження – характеристики мезенхімальних стромальних
клітин плаценти, внутрішньовенне введення мезенхімальних стромальних
клітин плаценти щурам з диметилгідразин-індукованим канцерогенезом
товстої кишки.
8
Методи дослідження: метод виділення первинних культур,
полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР),
цитофлуориметричні, флуоресцентна in situ гібридизація, гістологічні,
імуноцитохімічні, імуногістохімічні, трансдукція клітин еукаріот, світлова та
конфокальна мікроскопія, моделювання ДМГ-індукованого канцерогенезу
товстої кишки щурів, статистична обробка результатів.
Наукова новизна отриманих результатів.
1. Вперше встановлено, що мезенхімальні стромальні клітини
плаценти щура фетального походження характеризуються імунофенотипом
та потенціалом до диференціювання властивим мезенхімальним стромальним
клітинам, однак у порівнянні з мезенхімальними стромальними клітинами
плаценти людини малють низький рівень експресії CD44 та не експресують
трофобласт-асоційовані гени.
2. Показана здатність мезенхімальних стромальних клітин плаценти
людини та щура приживлюватися в тканинах товстої кишки, легень, печінки
та селезінки щурів протягом одного тижня після внутрішньовенної
трансплантації інтактним щурам, а також в тканині пухлин товстої кишки
при трансплантації щурам з диметилгідразин-індукованим канцерогенезом
товстої кишки.
3. Вперше виявлено, що ксеногенна та алогенна трансплантація
мезенхімальних стромальних клітин плаценти щурам з диметилгідразиніндукованим канцерогенезом товстої кишки на середніх стадіях розвитку
пухлин не впливає на кількість новоутворень та показники загальної
середньої площі поперечного перерізу пухлин.
3. Вперше з’ясовано, що алогенна внутрішньовенна трансплантація
мезенхімальних стромальних клітин плаценти щурам з диметилгідразиніндукованим канцерогенезом товстої кишки призводить до зростання
розмірів пухлин з 4 ступенем інвазії.
4. Вперше показано, що внутрішньовенна алогенна трансплантація
мезенхімальних стромальних клітин плаценти призводить до скорочення
9
тривалості виживання щурів із диметилгідразин-індукованим
канцерогенезом товстої кишки на 17 днів.
6. Функціональна та фагоцитарна активність перитонеальних
макрофагів та показники клітинного циклу спленоцитів не змінюються на 5
тиждень після внутрішньовенної алогенної трансплантації мезенхімальних
стромальних клітин плаценти щура на середніх стадіях диметилгідразиніндукованого канцерогенезу товстої кишки.
7. Показано, що при органному контактному і безконтактному
співкультивуванні мезенхімальних стромальних клітин плаценти щура з
слайсами пухлин товстої кишки щура не змінювалася проліферативна
активність і рівень апоптозу у тканинах пухлин.
Практичне значення одержаних результатів.
1. Дані про особливості культур мезенхімальних стромальних
клітин плаценти щура можуть бути використані для подальших їх
доклінічних досліджень за різного типу патологій.
2. Дані про розподіл та здатність до приживлення мезенхімальних
стромальних клітин плаценти щурячого та людського походження в
організмі щура можуть бути використані в дизайні подальших доклінічних та
клінічних випробувань.
3. Виявлені ефекти трансплантації мезенхімальних стромальних
клітин плаценти можуть бути використані для розробки рекомендацій щодо
використання клітинної терапії для пацієнтів з онкологічними
захворюваннями.
4. Результати доповнюють існуючі дані про системну імунну
реакцію перитонеальних макрофагів та лімфоцитів селезінки на середніх
стадіях типового перебігу диметилгідразин-індукованого канцерогенезу
товстої кишки щура, а також при алогенній трансплантації мезенхімальних
стромальних клітин плаценти.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним
науковим дослідженням. Планування та обговорення усіх етапів дослідження
10
здійснено спільно з науковим керівником, директором та заступником
директора Банку пуповинної крові та інших клітин і тканин людини к.б.н.
Лобинцевою Г.С. та к.б.н. Шаблієм В.А. Особисто здобувачем було
проведено виділення МСКП щура, визначено їх здатність до
диференціювання у адипогенному та остеогенному напрямках, проведено
імуноцитохімічні дослідження та FISH-аналіз отриманих культур.
Здобувачем було проведення моделювання ДМГ-індукованого канцерогенезу
товстої кишки щура, проведено внутрішньовенну трансплантацію МСКП
щура та МСКП людини, макроскопічний і гістологічний аналіз утворених
пухлин, імуногістохімічні дослідження пухлин, проведено всі статистичні
розрахунки. Отримання МСКП людини проводили спільно зі
співробітниками Банку пуповинної крові та інших клітин і тканин людини.
Проточну цитометрію проводили спільно з завідуючим лабораторією
клітинних та тканинних культур Державної установи «Інститут генетичної та
регенеративної медицини» Національної академії медичних наук України"
(м. Київ) к.м.н. Кириком В.М. Виділення РНК та ДНК з культур клітин та
органів щурів, ЗТ-ПЦР проводили спільно зі співробітниками відділу
біосинтезу нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології і генетики
НАН України (м. Київ) к.б.н. Скрипкіною І.Я. та к.б.н. Арешковим
П.О.Дослідження параметрів клітинного циклу та рівня апоптозу проводили
спільно з завідуючою НДЛ експериментальної онкології Національного
інституту раку (м. Київ) к.б.н. Храновською Н.М. та к.б.н. Скачковою О.В.
Одержані результати обговорено і опубліковано в спільних статях.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень,отримані в
рамках виконання дисертаційної роботи, представлені у вигляді тез, усних і
стендових доповідей на вітчизняних та міжнародних наукових конференціях,
зокрема World Cord Blood Congress III (Рим, Італія, 2011); IV Young
Scientists’ Conference of Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of
Ukraine in honor of the 155-year anniversary of Sergei G. Navashin (Київ,
Україна, 2012); International Symposium on Cell Biology jointly with 3rd
11
Ukrainian Congress for Cell Biology (Ялта, Україна, 2012); International Society
for Stem Cell Research 10th Annual Meeting (Йокогама, Японія, 2012);
науково-практичної конференції з міжнародною участю «Актуальні
проблеми регенеративної медицини» (Київ, Україна, 2012); International
Conference “Cell technologies in obstetrics, gynecology, neonatology and
pediatric neurology” (Київ, Україна, 2012); міжнародної конференції Cell
technology Week (Київ, Україна, 2013); International Society for Stem Cell
Recearch 12th Annual Meeting (Ванкувер, Канада, 2014); 3rd IPLASS Meeting
(Гранада, Іспанія, 2014); VII Міжнародної наукової конференції
«Психофізіологічні і вісцеральні функції і нормі і патології» (Київ, Україна,
2014); науково-практичної конференції з міжнародною участю
«Трансплантація – сьогодення, минуле та майбутнє» (Київ, Україна, 2014);
всесвітнього дня науки «Об’єднані наукою: перспективи міждисциплінарних
досліджень» (Київ, Україна, 2014); ХІІI міжнародної конференції молодих
вчених «Шевченківська весна: біологія» (Київ, Україна, 2015); науковопрактичної конференції з міжнародною участю «Сучасна онкологія:
діагностика та лікування» (для молодих вчених) (Київ, Україна, 2015);
“Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2015” (Київ, Україна, 2015);
міжнародної конференції ISSCR 2015 Annual Meeting (Стокгольм, Швеція,
2015); міжнародної конференції Advances in Cell Biology and Biotechnology
(Львів, Україна, 2015), 4rd IPLASS Meeting (Ер-Ріяд, Саудівська Аравія,
2016).
Публікації. За результатами досліджень опубліковано 15 наукових
праць, з яких 6 наукових статей у фахових виданнях, що відповідають
вимогам МОН України, з яких 3 в журналах, що індексуються міжнародною
наукометричною базою даних Scopus, а також 9 матеріалів і тез доповідей на
всеукраїнських та міжнародних наукових конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена
українською мовою на 130 сторінках і складається із вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів досліджень, 4 розділів результатів власних
12
досліджень із обговоренням, аналізу та узагальнення результатів досліджень,
висновків, списку використаної літератури (222 посилань, з яких 220 –
латиницею, 2 – кирилицею). Дисертація викладена і проілюстрована 34
рисунками та 7 таблицями.

Список литературы

ВИСНОВКИ
1. У дисертаційній роботі проведено детальний порівняльний аналіз морфо
функціональних характеристик мезенхімальних стромальних клітин
плаценти людини та щура. Встановлено здатність їх до приживлення у
різних тканинах органів щура за умов введення інтактним тваринам та
тваринам з індукованим канцерогенезом. Доведено недоцільність
використання МСКП за канцерогенезу товстої кишки, так як відмічено
підсилення інвазивного росту пухлин та скорочення терміну виживаності.
2. Мезенхімальні стромальні клітини плаценти щура фетального походження
так само як і мезенхімальні стромальні клітини плаценти людини мають
CD90+CD29+/lowCD45- імунофенотип та здатність до диференціювання у
адипогенному та остеогенному напрямках.
3. У мезенхімальних стромальних клітинах плаценти щура порівняно з МСКП
людини, відсутня експресія пан-цитокератину та трофобласт-асоційованих
генів, а також низький рівень експресії CD44.
4. МСКП людини, як МСКП щура приживлюються в тканинах кишечника,
легень, печінки та селезінки інтактних щурів у віддалені терміни після
внутрішньовенної трансплантації.
5. Ксеногенна внутрішньовенна трансплантація МСКП щурам з ДМГіндукованим канцерогенезом товстої кишки на середніх стадіях
канцерогенезу не впливає на кількість та площу пухлин.
6. Алогенна внутрішньовенна трансплантація МСКП щурам з ДМГіндукованим канцерогенезом товстої кишки зумовлює збільшення розмірів
пухлин з 4 ступенем інвазії, не змінюючи при цьому фагоцитарну
активність перитонеальних макрофагів та показників клітинного циклу
спленоцитів, та призводить до скорочення виживаності щурів на 17 діб.
7. При контактному і безконтактному співкультивуванні МСКП щурів з
слайсами пухлин товстого кишечника щурів не впливають на
проліферативну активність і рівень апоптозу у пухлинах.